冠心病患者循环中EPCs与VEGF的关系及临床意义

　　作者：王进,郑奇军,彭阳红,刘维永　　作者单位：第四军医大学西京医院心脏外科，陕西 西安

　　【摘要】目的: 研究冠心病患者循环中血管内皮生长因子(VEGF)与内皮祖细胞(EPCs)的关系及临床意义. 方法: 55例入选者均经冠状动脉造影根据有无冠状动脉狭窄而分为两组：冠心病组30例，对照组25例. 采集入选者外周血，体外培养扩增内皮祖细胞，7 d后通过倒置相差显微镜计数内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU)评估外周血EPC水平，同时用ELISA法检测血浆中VEGF水平，分析冠脉组病人VEGF与EPCs的关系. 结果: 冠心病组VEGF水平低于对照组[(19.6±6.9 )pg/mL vs (35.4±9.4)pg/mL,P<0.001)];冠心病组血循环中EPC-CFU数量也较对照组降低(12.4±4.2 vs 19.0±5.1,P<0.001);血循环EPCs数量与VEGF浓度成正相关(r=0.493，P< 0.01). 结论: VEGF的下降可能是导致血循环中EPCS的减少的原因，可能参与了冠心病的发生和发展.

　　【关键词】 冠状动脉疾病 内皮祖细胞 血管内皮生长因子类

　　Relationship between vascular endothelial growth factor and circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease and its clinical significance

　　WANG Jin,ZHENG Qi-Jun,PENG Yang-Hong,LIU Wei-Yong

　　Department of Cardiovascular Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710033,China

　　【Abstract】AIM: To investigate the correlation between vascular endothelial growth factor (VEGF) and circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in coronary artery disease (CAD) patients and its clinical significance. METHODS: Fifty-five patients were divided into two groups: 30 patients with coronary artery diseases (CAD) and 25 control patients with angiographically normal coronary arteries. After 7 days of culture，the number of EPCs colony-forming units(EPC-CFU) was counted under phase-contrast microscope. The plasma level of vascular endothelial growth factor (VEGF) was determined by ELISA. Relation between the level of VEGF and the number of EPCs was analyzed in patients with CAD. RESULTS: The level of VEGF in the CAD group was significantly lower than that in the controls [(19.0±3.8)pg/mL vs (34.2±4.6)pg/mL,P<0.001]. The number of EPC-CFU in CAD group was significantly lower than that in the controls (9.8±2.9 vs 18.9±4.3 P<0.001). A positive correlation between the plasma level of VEGF and the number of EPC-CFU(r=0.493，P<0.01) was also observed. CONCLUSION: The decline of VEGF may induce the decrease of circulating EPC and be involved in the occurrence and development of coronary heart diseases.

　　【Keywords】 coronary disease; endothelial progenitor cells; vascular endothelial growth factors

　　0 引言

　　内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类来源于骨髓、增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞[1]，自从1997年首次从外周血中分离出来后，大量研究表明其不仅参与胚胎发育过程中的血管发生，而且在出生后具有促进新生血管生成及损伤血管修复、改善内皮功能、抑制动脉粥样硬化进展等作用[2-4]. 已有研究表明VEGF是EPCs激活的重要细胞因子，但是在冠心病中他们之间的关系还不太清楚. 本实验检测了外周血中VEGF的含量，并从外周血分离培养EPCs，计数EPC-CFU来定量冠心病患者血中循环内皮祖细胞的数量，探索冠心病EPCs变化与VEGF的关系及临床意义.

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 研究经第四军医大学医学伦理委员会批准，所选患者均签署了知情同意书. 选取2006-12/2007-04期间55例患者分为两组：冠心病组30例，对照组25例(均经冠状动脉造影明确诊断). 两组病人在年龄、性别、和心血管危险因素之间没有显著性差别(P>0.05). 其中冠心病组以冠脉造影结果分为单支病变组12例，双支病变组11例，三支病变组7例. 排除标准为：妊娠，香豆素抗凝治疗中的患者，患有凝血功能紊乱，肝脏功能不全，肾病需透析者，用免疫调节剂如类固醇和抗炎症因子，2 mo内服用过他汀类药物治疗的患者等.

　　1.2 方法

　　1.2.1 EPC的分离、培养和鉴定 外周血单个核细胞用淋巴细胞分离液(1.077，上海试剂二厂)通过密度梯度离心的方法获得. 离心洗涤后将单个核细胞重悬于含200 mL/L胎牛血清的M199培养基(Sigma公司)，然后以5×106/孔的密度在fibronectin(sigma公司)包被的6孔板上培养，培养48h后，将未粘附的细胞吸出来计数后重悬于添加了200 mL/L胎牛血清(Hyclone公司)，VEGF，bFGF,IGF-1，EGF(均来自Peprotec公司)的M199培养液中，然后以1×106/孔置于fibronectin包被的24孔板内. 在培养的第5天换液，于第7 d在倒置相差显微镜下随机选取3个视野，分别计数内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU)数目，取平均值. 实验者和另外一个专业的实验室技师双盲计数，评价重复性，变异系数<10%.

　　1.2.2 免疫荧光鉴定 培养细胞至第7日，细胞与10 μg/mL的DiI-acLDL，37℃孵育4 h，检测EPCs对DiI-acLDL的摄取，然后用2%多聚甲醛固定细胞10 min，用PBS浸洗，将10 μg/mL的FITC-UEA-I加于上述标本，于37℃下孵育1 h，激光共聚焦显微镜(Olympus)鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL双阳性细胞为正在分化的EPCs.

　　1.2.3 VEGF测定 抽取外周血，3 h内以2000 r/min离心10 min，分离血浆，用市售的ELISA试剂盒(R&D systems，Germany)按说明测定VEGF的含量.

　　统计学处理: 计量数据以x±s表示，均数比较采用单因素方差分析,双变量相关性分析采用Pearson相关方法. 数据用SPSS 13.0统计软件包处理，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 EPCs的培养和鉴定 内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU)为一个圆形的细胞团核心，外周有扁平、梭形、放射状细胞的细胞集落(图1). 用DiI-acLDL及FITC-UEA-I对细胞染色后，通过荧光显微镜观察，发红色荧光的为DiI-acLDL阳性细胞，发绿色荧光的为FITC-UEA-I(lectin)阳性细胞，染色双阳性细胞为正在分化的EPCs(图2).

　　2.2 各组EPC-CFU的数量和VEGF水平的关系 冠心病组EPC-CFU的数量和VEGF的水平均较对照组显著降低(P<0.001,表1)，发现单支病变组EPC-CFU数量较双支病变组和三支病变组的EPC-CFU的数量高(P<0.05)，双支和三支病变组之间EPC-CFU水平无统计学差异(P>0.05)，VEGF的水平在单支病变组要比双支病变组和三支病变组高(P<0.05)，双支和三支病变组之间VEGF水平也无统计学差异(P>0.05,表1). 冠脉组中EPC-CFU的数量和VEGF的水平呈正相关(r=0.493，P<0.01,图3).

　　图1 外周血中培养的内皮祖细胞集落形成单位(EPC-CFU)×100(略)

　　A：细胞摄取ac-LDL(绿色); B：细胞结合UEA-1结合(红色); C：双染色阳性为正在分化的EPCs.

　　图2 EPC的DiI-acLDL和FITC-UEA-1染色 ×200(略)

　　表1 EPC-CFU计数和VEGF水平(略)

　　aP <0.05 vs 对照; c P<0.05 vs双支,三支病变.

　　3 讨论

　　内皮损伤和功能障碍与冠心病密切相关，内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间动态平衡的破坏[5]. 近年来发现来源于骨髓的循环内皮祖细胞(EPCs)对血管损伤后再内皮化和促进缺血组织内源性血管形成起重要作用[1]. EPC-CFU细胞反映了循环EPCs中有活性的亚群，是一种很好的评价EPC数量和功能的方法[6-7].

　　图3 冠脉组循环中EPC-CFU和VEGF的相关性分析(r=0.493，P<0.01) (略)

　　为研究循环EPCs和冠心病病变程度，以及VEGF之间的关系及临床意义. 本实验通过计数EPC-CFU的方法研究循环中EPCs的数量和功能，发现冠心病患者外周血EPCs的数量与对照组比较明显减少，且双支和三支病变组EPC-CFU的数量较单支病变组减少. 说明冠心病患者EPCs的数量和功能都是下降的，而且血循环EPCs水平下降的程度与冠心病的严重程度有关，冠心病病变越严重，血循环EPCs的水平越低. 提示冠心病的发生和冠脉病变的严重程度可能和血循环中EPCs的减少有关，血循环EPCs的减少及功能损伤可能会导致冠心病患者冠脉自身修复能力下降和缺血心肌血管再生功能下降.

　　血管内皮生长因子(VEGF)能够有效增加内皮通透性，特异性地促进内皮细胞生长，促进体内的血管新生. Asahara等[8]发现VEGF在出生后能从骨髓中动员内皮祖细胞到外周血，能够调节出生后EPCs生长，给予VEGF能够有效增加外周血中的EPCs水平. Ohki等[9]发现，G-CSF刺激中性粒细胞释放VEGF，促进血管形成环境来进一步促进局部EPCs募集. 在冠心病患者中，VEGF是否是调节EPC水平的主要因子呢?本实验中冠心病组外周血VEGF水平较对照组减少，且双支和三支病变组VEGF的水平较单支病变组降低，而且发现冠脉组中循环EPCs的量随着VEGF浓度的下降而降低，而且两者之间成正相关(r=0.493，P<0.01)，从而提示VEGF很有可能在冠心病患者血循环EPC水平调节和维持中起重要作用. VEGF的水平降低一方面通过直接降低内皮细胞(EC)的增殖而使冠脉自身修复能力下降[10]，另一方面可能通过某种途径减少循环EPCs的水平进而导致冠脉自身修复能力下降和缺血心肌血管再生功能下降.

　　【参考文献】

　　[1] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science，1997，275:964-967.

　　[2] Tateishi-Yuyama E,Matsubara H,Murohara T,et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and randomised control trial[J]. Lancet，2002，360:427-435.

　　[3] Ishida A,Ohya Y,Saduka H,et al. Autologous peripheral blood mononuclear cell implantation for patients with peripheral arterial disease improves limb ischaemia[J]. Circ J 2005，69:1260-1265.

　　[4] Assmus B,Schachinger V,Teupe C,et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI)[J]. Circulation，2002，106:3009-3017.

　　[5] Hill J M,Zalos G,Halcox J P,et al. Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk[J]. N Engl J Med，2003，348:593-600.

　　[6] George J,Shmilovich H,Deutsch V,et al. Comparative analysis of methods for assessment of circulating endothelial progenitor cells[J]. Tissue Eng,2006，12:331-335.

　　[7] Roberts N,Xiao Q Z,Weir G,et al. Endothelial Progenitor cells are mobilized after cardiac surgery[J]. Ann Thorac Surg,2007,83:598-605.

　　[8] Asahara T,Takahashi T,Masuda H,et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J]. EMBO J,1999,18:3964-3972.

　　[9] Ohki Y,Heissig B,Sato Y,et al. Granulocyte colony-stimulating factor promotes neovascularization by releasing vascular endothelial growth factor from neutrophils[J]. FASEB J,2005,19: 2005-2007.

　　[10] Ferrara N,Henzel W J. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1989,161:851-855.