plk1、Raf1和Ki67在胃癌组织中的表达及其意义
发表时间：2010-10-28 浏览次数：306次
作者：陈壮威， 戴起宝， 兰 斌， 张洪生， 陈绍勤， 高爱明 作者单位：1.福建省人民医院 肿瘤科，福州 350004; 2.福建医科大学 附属第一医院肿瘤科，福州 350005; 3.福建省人民医院 病理科，福州 350004
【摘要】 目的 探讨plk1、Raf1和Ki67在胃癌组织中的表达及其相关性，分析它们的表达与胃癌临床病理指标之间的关系。 方法 采用免疫组织化学SP法检测80例胃癌组织和15例癌旁正常胃组织中plk1、Raf1和Ki67的表达水平。 结果 80例胃癌组织中plk1、Raf1和Ki67的阳性表达率分别为82.5%(66/80)、81.3%(65/80)、80.0%(64/80)，15例癌旁正常胃组织中均未见表达。plk1和Raf1表达与胃癌的浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移显著相关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度无相关性;Ki67表达与胃癌的分化程度、浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移显著相关(P<0.01)，而与其它因素无关。plk1与Ki67、Raf1与Ki67、plk1与Raf1的表达显著相关(P<0.01)。 结论 plk1、Raf1和Ki67的过表达可能与胃癌的发生发展有关，三者联合检测可为判断胃癌生物学行为乃至预后提供重要的参考指标。
【关键词】 胃肿瘤; Ki67抗原; 蛋白激酶类; 免疫组织化学
保罗样激酶1(polo like kinase 1，plk1)是一类广泛存在于真核细胞中的呈周期依赖性表达的丝/苏氨酸激酶，其结构及功能均十分保守。已知plk1在启动、维持及完成有丝分裂中扮演重要角色[1]。另外，plk1不但与细胞过度增殖及肿瘤发生有关，还与肿瘤的其他生物学行为紧密相关。Smith等将plk1转染NIH3T3细胞发现plk1可使细胞恶性转化，认为plk1具备癌基因的特点[2]。本研究采用免疫组织化学SP法检测plk1、Raf1激酶(Raf1)与细胞核增殖抗原(Ki67)在人胃癌组织和正常胃组织中的表达，探讨各指标之间的相关性及其与胃癌临床病理特征之间的关系，并为胃癌可能的靶向治疗提供实验线索。
1 材料与方法
1.1 对象 选取1993年1月-2005年1月胃癌手术患者80例，男性45例，女性35例，年龄中位数63岁(26～84岁)。患者均为首次手术，术前未接受放、化疗及免疫治疗，临床和病理资料均完整。肿瘤位于贲门胃底、胃体、胃窦，各27、27、26例;标本均经病理学确诊，并按组织学类型和分化程度分2组[3]：乳头状及管状腺癌归为高/中分化组，低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌及未分化癌归为低分化组;临床分期按1997年WHO国际抗癌联盟(UICC)制定的胃癌分期标准(pTNM)执行。另取距肿瘤边缘>5 cm的同期癌旁正常胃组织15例作为对照组。标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别行HE染色及免疫组织化学染色。
1.2 试剂 第一抗体plk1、Raf1、Ki67为鼠抗人单克隆抗体;plk1、Raf1(美国Santa Cruze生物技术公司)，Ki67抗体、SP免疫组化超敏染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
1.3 方法 SP染色步骤按试剂盒说明书进行，用已知的plk1、Raf1和Ki67阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判断
1.4.1 plk1/Raf1 由2位资深病理科医师独立观察每张切片后综合判断。光学显微镜下每张切片随机观察10个具有代表性的高倍视野，plk1、Raf1染色以在细胞膜和/或细胞质着棕色颗粒为阳性。依照各自染色强度及染色细胞数进行综合分析评分量化：不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分;着色细胞占计数细胞百分率<5%为0分，5%～25%为1分，26%～75%为2分，>75%为3分;每张切片染色得分与阳性细胞百分率得分各自相乘为最后得分，0～1为(-)，2～3分为(+)，4～6分为()，>6分为()。
1.4.2 Ki67 以细胞核着棕褐色颗粒为阳性。每张切片随机观察10个具有代表性的高倍视野，计数100个肿瘤细胞的阳性细胞数，以<10%为(-)，10%～25%为(+)，26%～50%为()，>50%为()。
1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件包进行分析。采用精确概率检验、卡方检验、秩和检验与 A：plk1阳性表达位于胃癌细胞质与细胞膜中，呈棕色颗粒或团块;B：Raf1阳性表达位于胃癌细胞质与细胞膜中，呈棕色颗粒或团块;C：Ki67阳性着色位于细胞核，呈棕褐色颗粒或团块.plk1、Raf1和Ki67在胃癌组织中的表达及其意义Spearman等级相关分析。以P<0.05为差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 plk1、Raf1及Ki67的表达特点及其与胃癌临床病理指标的关系 plk1、Raf1阳性表达均位于胃癌细胞质与细胞膜中，呈棕色颗粒或团块(图1A、B)，Ki67阳性着色位于细胞核，呈棕褐色颗粒或团块(图1C)。80例胃癌组织中plk1、Raf1和Ki67的阳性表达率分别为82.5%(66/80)、81.3%(65/80)、80.0%(64/80)，15例癌旁正常胃组织中均未见表达。plk1和Raf1表达与胃癌的浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移显著相关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度无相关性;Ki67表达与胃癌的分化程度、浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移显著相关(P<0.01)，而与其他因素无关(表1)。
2.2 plk1、Raf1与Ki67表达的相关性 相关分析显示，随着Ki67表达增强，plk1及Raf1表达程度均逐渐增强，相关系数分别为r=0.641、P<0.01及r=0.704，P<0.01(表2);随着Raf1表达增强，plk1表达程度逐渐增强，相关系数为r=0.929，P<0.01(表3)。
3 讨 论
plk1为保罗样激酶家族中的一员，是一类广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸激酶，其结构与功能均十分保守，具体表现为N端有一个高度保守的催化区域，C端常有3个被称作polo盒的保守区域，与底物的丝/苏氨酶特异性结合，亚细胞定位及自身活性调整有关[4]。plk1在细胞周期中主要作用为启动及维系有丝分裂的正常进行,是细胞分裂不可或缺的关键激酶。近来的研究发现，plk1的过表达可导致细胞的恶性转化，并陆续在各恶性实体瘤中发现其表达上调，显示plk1在不同的实体瘤中与特定生物学行为及预后存在关联[59]。本研究显示，plk1在胃癌组织中的阳性表达率为82.5%(66/80)，而正常胃组织中未见阳性表达，差别具有统计学意义。这与Tokumistu等的研究基本一致[7]，进一步证实了plk1在多数实体肿瘤组织中过表达，plk1可能是实体肿瘤发生及发展的重要因素。另外，本研究中胃癌组织中plk1的表达与患者性别、年龄、肿瘤所在部位及分化程度无关，而与浸表1 p1k1、Raf1和Ki67表达与胃癌临床病理指标的关系1的表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关，P<0.05;Ki67的表达与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关，P<0.01.表2 p1k1、Raf1和Ki67表达之间的关系表3 p1k1表达与Raf1表达之间的关系润深度、淋巴结转移以及TNM分期密切相关(P<0.05)，提示plk1的表达与胃癌的恶性生物学行为有关，并且plk1过表达的患者肿瘤恶性度较高，这一结果可能有助于今后应用plk1对胃癌的生物学行为及预后进行判定。
Raf1激酶是原癌基因cRaf1的表达产物，由648个氨基酸组成，相对分子质量为70～74 kD，具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，其分子结构中含有CR1、CR2、CR3共3个保守区域。细胞信号转导通路RasRafMEKERK的过度激活是肿瘤恶变的一个关键事件，通路受抑制在体外可以阻断细胞转化，在体内可以抑制肿瘤生长[10]。Ras或Raf的突变均能使其处于持续的激活状态，而这种持续的激活状态则可导致肿瘤的发生。目前研究证实Raf1在一些肿瘤中常常存在着高表达，并在细胞增殖分化相关信号转导途径中起着关键作用。本研究也显示，Raf1在胃癌中存在着高表达，并与胃癌浸润程度，TNM分期、淋巴结的转移呈正相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤所在部位及分化程度无显著相关。由此推测，Raf1参与的细胞增殖信号传导通路可能在胃癌的发生及恶性演进中发挥作用，对胃癌的判定与预后有一定意义。
Ki67抗原是典型的与细胞周期相关的核蛋白，在增殖细胞周期的G1、S、G2和M期皆表达，其表达水平能较全面客观地反映肿瘤细胞的增殖状态，是公认的细胞增殖活性标志物。本研究发现Ki67不仅在胃癌组织中高表达，而且其表达与胃癌的分化程度、浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移密切相关(P<0.01)，而且随着肿瘤TNM分期、浸润程度的升高，表达越强烈，与其他学者的研究结果有相似之处[1112]。提示Ki67表达强的胃癌具有较高的恶性程度，Ki67与肿瘤的生长、侵袭及转移能力密切相关。因此Ki67是胃癌诊断与判定预后的一项重要指标。
本实验胃癌plk1、Raf1及Ki67表达较高，三者均与胃癌的浸润程度、TNM分期以及淋巴结的转移有关，联合检测对判断胃癌恶性程度、进展及预后比单一指标可能更有意义。plk1、Raf1、Ki67三者间均存在相关性，由此推测，作为均与细胞增殖相关的分子，这三项指标在癌细胞增殖过程中均不同程度地发挥了作用，其表达强度具有关联性，三者皆可作为反映胃癌细胞增殖程度的指标，至于三者是否在细胞信号转导中存在对话或上下游间存在调节关系有待进一步研究。
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