以MAGE A1A6亚型基因mRNA为特异标记检测肺癌细胞

　　作者：唐艳 夏大文 李亚荣 万敏 菜元本 作者单位：吉林大学第二医院肿瘤内科，吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 探讨肺癌患者痰液及外周血中黑色素瘤抗原基因(MAGE)A1A6亚型 mRNA的表达及其对早期肺癌的诊断意义。方法 应用巢式RTPCR技术，对23例肺癌病人、8例肺良性病变者和10例健康人的痰液及外周血中MAGE A1A6亚型基因的 mRNA表达进行检测。结果 23例肺癌病人中7例检测到痰液脱落细胞中有MAGE A1A6亚型基因mRNA表达,检出率30.4%(7/23);9例检测到外周血有表达,检出率39.1%(9/23);痰液和外周血肺癌细胞联合检出率为47.8%(11/23)，大于痰液细胞学检查检出率17.4%(4/23)(P<0.05)。而肺良性病变者和健康人中均未检测到MAGE A1A6亚型基因mRNA的表达。结论 MAGE A1A6亚型基因的 mRNA可作为检测肺癌患者痰液和外周血癌细胞的标记物，两者联合检测有助于提高肺癌的检出率。

　　【关键词】 肺肿瘤 黑色素瘤抗原基因 巢式逆转录聚合酶链反应

　　MAGE A16 isoforms genes mRNA as specific markers in detection of tumor cells in lung cancer

　　TANG Yan, XIA DaWen, LI YaRong, et al.

　　Department of Oncology, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To explore the expression of melanoma antigen gene (MAGE) A16 isoforms genes mRNA in sputum and peripheral blood of patients with lung caner and its clinical significance in early diagnosis of lung cancer. Methods The expression of MAGE A16 isoforms genes mRNA was detected in sputum and peripheral blood from 23 patients with lung caner, 8 patients with benign pulmonary lesion and 10 healthy adults by nested RTPCR. Results The positive rates of MAGE A16 isoforms genes mRNA were 30.4% (7/23) and 39.1% (9/23) in sputum and peripheral blood from lung cancer patients, respectively. The united detection rate of the genes in sputum and peripheral blood, 47.8% (11/23) was significantly more than 17.4% (4/23), the detection rate of sputum cytology (P<0.05). No MAGE A16 isoforms genes mRNA expression was found in the samples from patients with benign pulmonary lesion and healthy adults. Conclusions MAGE A16 isoforms genes mRNA may be a valuable marker for detecting tumor cells in sputum and peripheral blood of lung cancer patients, and their united detection will do benefit to improve the detection rate of lung cancer.

　　【Key words】 Lung tumor; Melanoma antigen gene (MAGE);RNA; RTPCR

　　PCR基因诊断技术可极大提高肺癌细胞检测灵敏度。据国外报道，采用黑色素瘤抗原基因(MAGE)A1A6亚型通用引物通过巢式RTPCR法可使痰液脱落细胞的肺癌细胞检出率提高到70%〔1〕，目前国内尚未见报道;另外，以该方法检测可疑肺癌患者外周血肺癌细胞从而辅助诊断肺癌，目前也未见报道。笔者采用肿瘤特异性抗原MAGE A1A6 6个亚型基因的mRNA作为标记物，首次建立了采用巢式RTPCR检测肺癌患者痰液脱落细胞及外周血单个核细胞中肺癌细胞的方法,并对检测结果的临床意义进行初步探讨。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 我院收治的23例肺癌患者均经病理科确诊，其中男14例，女9例，年龄30～83岁，平均年龄60.5岁。另8例肺良性疾病病人(肺结核5例、肺霉菌球1例、肺囊肿合并感染1例、支气管炎1例)和10例正常健康人作为阴性对照。病理类型为鳞癌9例，腺癌11例，小细胞未分化癌2例，细支气管肺泡癌1例。肿瘤TNM分期为Ⅰ期者2例,Ⅱ期7例,Ⅲ期11例,Ⅳ期3例。以5例肺癌患者手术中取得的新鲜肿瘤组织标本作为阳性对照,痰液脱落细胞的细胞学检查参见我院病理科脱落细胞室诊断报告。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂 Trizol试剂为美国Invitrogen产品;Ficoll试剂,DNA Tag酶及pMD18T 载体购自北京鼎国生物化学公司;一步法RTPCR试剂盒为美国Promega公司生产。

　　1.2.2 痰液采集及处理 采集每例入选者治疗前自然咯出痰及诱导痰液共5 ml，痰液采集方法如下:(1)自然痰：以温水漱口3次，鼓励咯出深部痰，留取第1口以后的痰作标本。(2)诱导痰：于超声雾化器雾化杯中加入4%的NaCl溶液10 ml，吸入高渗盐溶液15～25 min，嘱病人漱口，用力咯出深部痰。痰液处理方法：合格痰中加入4倍体积0.3%二硫苏糖醇(DTT)充分混合，将痰液置37℃水浴10 min，分置于5个试管,以1 000 r/min离心5～10 min，收集沉淀,每管加入Trizol 1 ml,用一次性注射器反复抽打形成清亮不黏稠液体,-70℃冻存。

　　1.2.3 血液标本采集及处理 采集上述入选者的外周血5 ml,密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，每份加入1 ml Trizol,用一次性注射器进行反复抽打形成清亮不黏稠的液体,-70℃冻存。

　　1.2.4 总RNA提取 Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。

　　1.2.5 引物设计及合成 根据文献〔2〕提供序列合成引物。 MAGE A16外引物：上游：5′CTGAAGGAGAAGATCTGCC3′,下游：5′CTCCAGGTAGTTTTCCTGCAC3′,扩增片段长度831～855 bp;MAGE A16内引物：上游：5′CTGAAGGAGAAGATCTGCCWGTG3′,下游：5′CCAGCATTTCTGCCTTTGTGA3′，扩增片段长度为469～493 bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.2.6 一步法RTPCR扩增 (1)首轮PCR。PCR反应体积：痰液标本为20 μl，血液标本为50 μl，Mg离子浓度为1 mmol/L，dNTP浓度为0.2 mmol/L，引物浓度为1 μmol/L，总量RNA加上10 U的AMV逆转录酶和5 U的Tfl DNA 聚合酶，于PTC200型PCR仪内扩增。条件为45℃延伸45 min及94℃ 2 min各1循环;94℃变性30 s，60℃退火1 min，68℃延伸2 min，共进行45个循环;最后一个循环结束后，68℃延伸7 min。在第二轮巢式PCR时，PCR反应体系为50 μl,将首轮PCR产物的1 μl做为扩增模板，分别加入0.5 μmol的内引物,0.2 mmol/L dNTP浓度,0.6 U Tag DNA合成酶。条件为94℃,30 s;60℃,45 s;72℃,45 s;30循环，并在72℃延长10 min。

　　1.2.7 RTPCR产物鉴定 巢式RT-PCR产物加样于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外光凝胶成像系统扫描。

　　1.3 统计学分析 采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 痰液脱落细胞巢式RTPCR 23例肺癌患者的痰液脱落细胞中,表达MAGE A1A6基因mRNA者为30.4%(7/23)，8例支气管良性疾病患者痰液中未检测到该组基因的表达。其PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图1。

　　1.DL2000 Marker 2.MAGE A1A6 mRNA 巢式RTPCR产物 3.MAGE基因阳性对照 4.MAGE基因阴性对照

　　图1 检测痰液脱落细胞中MAGE A1A6 mRNARTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳(略)

　　1.DL2000 Marker 2.MAGE基因阴性对照 3.MAGE基因阳性对照 4,5：MAGE A1A6 mRNA 巢式RTPCR产物阴性结果 6,7.MAGE A1A6 mRNA 巢式RTPCR产物阳性结果

　　图2 检测外周血PBMC中MAGE A1A6 mRNARTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳(略)

　　2.2 外周血PBMC的巢式RTPCR 用巢式RTPCR方法对来源于PBMC的cDNA进行两轮扩增后,39.1%(9/23)肺癌患者的外周血标本呈MAGE A1A6基因mRNA阳性。痰液脱落细胞表达MAGE基因的7例患者中,其外周血中可检测到MAGE者71.4%(5/7)。痰液脱落细胞未表达MAGE基因者，其外周血中可检测到MAGE者25.0%(4/16)。 8例支气管良性疾病患者以及10例健康人的PBMC中均未检测到MAGE基因的表达。其PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图2。

　　2.3 MAGE A1A6巢式RTPCR与痰液脱落细胞细胞学检查肺癌检出率的比较 痰液脱落细胞及外周血PBMC的MAGE A1A6巢式RTPCR的肺癌检出率为30.4%(7/23)和39.1%(9/23)，分别均大于痰液脱落细胞细胞学检查检出率17.4%(4/23),但均无统计学意义(P>0.05)。而痰液脱落细胞及外周血PBMC的MAGE A1A6巢式RTPCR的肺癌联合检出率47.8%(11/23)大于痰液脱落细胞细胞学检查检出率,且有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　肺癌的早期诊断是提高治疗效果的有效途径。传统的痰细胞学检查虽是筛查肺癌必不可少的工具，然而,其检测水平有待进一步提高〔3〕。PCR由于灵敏度高，操作简便快捷，是近年来应用比较多的基因诊断技术，可使检测水平达到10-4～10-7。肿瘤标志物是指肿瘤组织产生的可以反映肿瘤自身存在的物质，通常是肿瘤细胞的表面抗原，近年来，已成为恶性肿瘤早期诊断的重要指标〔4〕。

　　黑色素瘤抗原基因MAGE是常见肿瘤标志物之一，仅特异高表达于癌组织，如肺癌、胃癌、食管癌等，但在正常组织(胎盘和睾丸组织除外)不表达或微量表达〔5〕。MAGE是一种特异性很高的肿瘤标志物，但其每一种亚型在癌组织中的单独表达率均较低。2002年，由ChangHo〔2〕主持的课题组创建了一种采用MAGE A1A6 6种亚型的通用引物进行巢式RTPCR，从而在多种癌组织中检测MAGE的方法〔2〕。2004年，该课题组在已创建方法的基础上，又进行了应用MAGE A1A6通用引物巢式RTPCR法检测痰标本肺癌细胞的研究，由于该方法能同时检测MAGE的6个不同亚型MAGE A1A6，故可明显提高MAGE基因的检出率，从而非常灵敏、高效地探测表达MAGE的癌细胞，在诱导痰液中检出率达到70%，远远超过传统的痰脱落细胞学检查〔1〕。目前，该项研究在国内尚未见报道。

　　根据上述文献，本研究采用MAGE A1A6通用引物及巢式RTPCR的方法，对23例肺癌患者的痰液进行了检测，MAGE A1A6阳性率(肺癌检出率)为30.4%(4/23),虽然大于本组痰脱落细胞的检出率,但较低于文献报道的41.8%(随机痰)及72.7%(诱导)的检出率。分析原因如下：(1)文献报道的研究在痰液RNA提取时采用一种先进的痰RNA提取试剂盒,极大提高了检测的敏感性,本组研究则采用传统的RNA提取方法,尽管采取了加大痰液标本留取量等措施，但检出率较低;(2)本组研究入选标本例数相对文献报道例数少。

　　许多肺癌在发现时已属中晚期，在患者的外周血中可以检测到微小癌灶的转移〔6，7〕。因此,笔者推断通过检测可疑肺癌患者外周血癌细胞,可以辅助诊断肺癌。黄同海等〔8〕最近采用巢式RTPCR法通过检测角蛋白Ck19 mRNA及人肺组织特异基因LUNX mRNA发现在Ⅰ期及Ⅱ～Ⅳ期非小细胞肺癌患者外周血中发生微转移或癌细胞转移的几率分别为38.9%和63.6%(Ck19 mRNA)，或44.4%和69.7%(LUNX mRNA)。与之相比较，本组研究采用MAGE A1A6通用引物及巢式RTPCR对肺癌患者外周血癌细胞检出率为39.1%(9/23)，与上述数值相似或略小，考虑与入选病例病理分型、临床分期及数量等有关。另一方面，本组研究显示外周血PBMC与痰脱落细胞的肺癌联合检出率为47.8%(11/23)，明显大于痰液脱落细胞的细胞学检查检出率(P<0.05)，说明外周血PBMC及痰脱落细胞MAGE A1A6 mRNA巢式RTPCR法联合检测可提高肺癌检出率。另外，在本组研究中,支气管良性疾病患者及健康人对照标本中均未检测到MAGE基因的表达,说明所采用的方法具有特异性。

　　【参考文献】

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