重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用

　　作者：刘广遐 王婷婷 胡文静 钱晓萍 禹立霞 刘宝瑞 作者单位：210008江苏省南京市，南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院肿瘤中心

　　【摘要】 目的 研究中药重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用。 方法 收集25例经病理确诊的恶性胸腹水并分离原代肿瘤细胞，用CCK8法检测原代细胞对重楼醇提物及化疗药的药物敏感性，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测重楼醇提物对凋亡相关蛋白survivin mRNA表达的作用。 结果 重楼醇提物对人胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等4株细胞系的半数抑制浓度(IC50)平均值为 41.13 μg/ml，对25例恶性胸腹水中原代肿瘤细胞IC50平均值为82.33 μg/ml，两者无显著差异(P>0.05)。重楼醇提物对大肠癌来源的腹水中原代肿瘤细胞的IC50值显著高于其他组(P<0.05)，对胃癌、肺癌及其他消化道肿瘤来源的胸腹水中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用无明显差异(P>0.05)。8例对重楼醇提物耐药的原代肿瘤细胞对多西紫杉醇、氟尿嘧啶、顺铂存在交叉耐药，而对化疗药物耐药的原代肿瘤细胞对重楼无交叉耐药。重楼醇提物对部分细胞系及原代细胞中凋亡相关蛋白survivin mRNA有下调作用(P<0.05)。 结论 重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞，尤其是对化疗药物耐药的肿瘤细胞仍有一定的抗肿瘤作用。

　　【关键词】 重楼醇提物; 原代肿瘤细胞; 恶性胸腹水

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30670958)

　　Anticancer effect of Rhizoma Paridis on primary cancer cells isolated from malignant pleural effusion and ascites

　　LIU Guang-xia, WANG Ting-ting, HU Wen-jing, QIAN Xiao-ping, YU Li-xia, LIU Bao-rui.

　　Department of Oncology, Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing Traditional Chinese Medicine University and Clinical Cancer Institute of Nanjing University, Nangjing 210008, China

　　【Abstract】　Objective To investigate the effect of Rhizoma Paridis on primary cancer cells isolated from the ascites or pleural fluids of patients with metastatic cancers. Methods Primary cancer cells were isolated from the malignant pleural effusion and ascites of 25 patients. Compared with culture cell lines, the response of these cancer cells to Rhizoma Paridis and chemotherapeutic agents commonly used in clinic were determined by CCK8 assay. Quantitative RT-PCR was used to examine the level of survivin mRNA. Results The primary cancer cells isolated from effusions showed sensitivity to Rhizoma Paridis with 50% inhibiting concentration(IC50) values of 82.33 μg/ml, similar to the IC50 in established cell lines. Patients with colon cancers were significantly more resistant to Rhizoma Paridis than patients with other cancers(P<0.05). Eight cases of cancer cells resistant to Rhizoma Paridis had increased tolerance to docetaxel, cisplatin and 5-fluorouracil. Significant down-regulation of survivin in cell lines and in primary cancer cells after the treatment of Rhizoma Paridis was observed(P<0.05). Conclusions This study shows Rhizoma Paridis might have the potential anticancer effect on primary cancer cells.

　　【Key　words】 rhizoma paridis; primary cancer cells; malignant pleural effusion and ascites

　　恶性肿瘤在老年人中的发病率甚高。恶性体腔积液是晚期恶性肿瘤常见并发症之一，但临床治疗尚无完全满意的方法，需要探索新的治疗药物，提高疗效。在中药抗肿瘤作用的研究中，已证实重楼醇提物有抗肿瘤、诱导凋亡等作用[1]，但都局限于其对体外细胞株的作用。本文研究了重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的细胞毒作用，试图发现重楼醇提物对恶性体腔积液中的原代肿瘤细胞尤其是对化疗药耐药的肿瘤细胞的抗肿瘤作用，为进一步临床研究提供依据。现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞株与细胞培养

　　人胃癌细胞株BGC-823、肝癌细胞株SMMC-7721、肺癌细胞株A549和大肠癌细胞株LOVO购自中国科学院上海细胞生物研究所，上述细胞均用含10%小牛血清的 RPMI1640，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　1.2 药物

　　重楼醇提物(产地：四川，用80%的乙醇连熬3遍，每次2 h，挥发干，称浸膏重，再用80%的乙醇溶解，制备成所需的浓度)。多西紫杉醇(Doc)、顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)均购自江苏恒瑞医药公司。所用药物100%测试药物浓度(TDC)分别为[2]：Doc 10 μg/ml、DDP 4.0 μg/ml、5-FU 40 μg/ml(100%TDC参考药物在人体内的血浆峰浓度)。药物敏感性判定：100%TDC浓度下抑制率>50%为高度敏感，抑制率为30%～50%为中度敏感，抑制率<30%为不敏感。

　　1.3 标本收集与原代肿瘤细胞的分离

　　收集2007年4月至2007年9月经病理科确诊的转移性恶性胸腹水25例。其中，胃癌9例，大肠癌4例，肝癌1例，胰腺癌2例，非小细胞肺癌9例。25例患者中，已接受全身化疗的8例。无菌条件下行胸/腹腔穿刺术，抽取恶性积液800～1000 ml至无菌容器中并送至实验室。将收集的胸腹水分装至50 ml离心管中，1500 r/min离心15 min，弃上清;在15 ml离心管中将7 ml细胞悬液小心加至7 ml Ficoll之上，2200 r/min离心25 min;吸取中间层至新管;加入40 ml D-Hanks液洗涤细胞;如沉淀中含有较多的红细胞，加入红细胞裂解液40 ml裂解红细胞;用含抗生素的RPMI1640再次洗涤细胞，台盼兰染色计算细胞活力。所分离的原代细胞经病理科确诊肿瘤细胞含量>50%。

　　1.4 CCK8法药物敏感性测定

　　取1.0×105/ml上述原代细胞接种于96孔U型悬浮培养板中,加入含药物的培养液(每种浓度设立3个复孔),并同时设立空白对照。将细胞置于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度的培养箱孵育72 h后取出,每孔加入10 μl的含WST-8的CCK8显色剂 (上海同仁化学研究所)，继续孵育4 h后, 自动酶标仪以460 nm波长测定各孔的吸光度(A)值，用复孔吸光度平均值进行比较。肿瘤细胞抑制率=(对照孔测定A值-实验孔测定A值)/(对照孔测定A值-空白孔测定A值)×100%。以药物浓度为横坐标，存活率为纵坐标绘制浓度效应曲线，求出回归方程，得出半数抑制浓度(IC50)。

　　1.5 RNA提取及荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

　　取药物作用前后的肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞，用PBS缓冲液洗细胞1次去除培养液后，加入1 ml总RNA提取试剂TRIZOL, 充分混匀后用0.2 ml氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤RNA，空气干燥，加20 μl无RNA酶水溶解。按照逆转录试剂盒(Takara)说明书步骤将RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR反应体系总体积为20 μl，含SYBR green染料(Takara)10 μl(2×)，引物1 μl，cDNA 2 μl。每个基因做3个复孔。PCR扩增条件为：95 ℃ 10 s 1个循环，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s 45个循环。熔融曲线反应条件为：95 ℃ 10 s，以0.1 ℃/s 的速度从65 ℃ 上升至95 ℃，排除非特异性扩增。软件分析其Ct值。以人总RNA(Clontech)作为校正，计算凋亡抑制基因与β-actin的相对定量值。

　　1.6 数据分析与统计

　　组间差异用Student-t 检验，相关性分析采用Pearsons 相关性分析，P<0.05表示差异有统计学意义。统计软件为SPSS 11.5。

　　2 结果

　　2.1 重楼醇提物对肿瘤细胞系及原代肿瘤细胞的作用

　　重楼醇提物对细胞系的抗肿瘤作用呈浓度依赖性，对胃癌细胞株BGC-823、肝癌细胞株SMMC-7721、肺癌细胞株A549和大肠癌细胞株LOVO的IC50值分别为49.9 μg/ml、35.5 μg/ml、26.3 μg/ml、52.8 μg/ml，见图1。在恶性胸腹水原代肿瘤细胞的研究中，重楼醇提物对原代细胞的IC50平均值为82.33 μg/ml，与细胞系的IC50值比较无统计学差异，其中对大肠癌来源的腹水中原代肿瘤细胞的IC50值为103.75 μg/ml，显著高于其他肿瘤来源组(P<0.05)，而对胃癌、肺癌及其他消化道肿瘤来源的胸腹水中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用无明显差异(P>0.05)。重楼醇提物对年龄、性别、体腔积液类型及是否接受全身化疗组间IC50值均无统计学差异。见表1。表1 重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的IC50值(略)注：与大肠癌细胞系IC50值比较，*P<0.05

　　2.2 重楼醇提物与化疗药的交叉耐药特性

　　在收集的25例原代肿瘤细胞中，对重楼醇提物IC50值>150 μg/ml的耐药细胞共有8例，分别为肺癌2例，胃癌3例，肠癌2例，胰腺癌1例。这8例原代肿瘤细胞对临床常用的Doc、DDP、5-FU化疗药物均有不同程度的交叉耐药。我们进一步研究了对化疗药物耐药的原代肿瘤细胞对重楼醇提物的耐药特性。我们收集了1例接受DFP方案(Doc+5-FU+DOP)化疗的胃癌患者在3个不同治疗阶段(治疗前，DFP治疗1周期及3周期后)的恶性腹水，并比较各种药物对不同阶段原代肿瘤细胞的抑制率。经DFP治疗后恶性腹水中的原代细胞对Doc及DDP的药物敏感性显著下降(P<0.05), 但重楼醇提物(50 μg/ml)对该耐药细胞仍有抗肿瘤作用。见表2。表2 重楼对化疗耐药原代肿瘤细胞的作用(略)注：与第1次收集标本比较，*P<0.05

　　2.3 重楼醇提物对凋亡相关蛋白的作用

　　为研究重楼醇提物对原代肿瘤细胞抗肿瘤作用可能的相关机制，我们测定了重楼醇提物对胃癌、肺癌、大肠癌、肝癌细胞系及相应原代细胞凋亡相关基因survivin mRNA表达的改变。实验发现，以不加重楼醇提物的细胞作为对照，重楼醇提物作用72 h后survivin mRNA表达在BGC-823、A549、LOVO和肺癌源性恶性胸水P-LU18中明显下调(P<0.05)。见图2。

　　3 讨论

　　重楼又称七叶一枝花,是百合科重楼属植物的泛称,以蚤休之名首载于《神农本草经》。据报道其化学成分主要为薯蓣皂苷和蚤休皂苷两类皂苷[3],并证明其中成分纤细薯蓣皂甙(Gracillin)、甲基原纤细薯蓣皂甙(Methylmotogracillin) 对肿瘤细胞有抑制作用[4],当浓度达到10 mg/ml时抑制率高达95%以上。既往研究均局限于重楼醇提物或水煎剂对细胞株的作用，本文首次研究了重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的作用，发现其IC50平均值为82.33 μg/ml，与细胞系的IC50值无明显差异，表明重楼醇提物对原代细胞与细胞系具有类似的抗肿瘤作用。25例原代细胞中有8例对重楼耐药，同时观察到这8例细胞对化疗药也存在交叉耐药，提示对重楼醇提物耐药的细胞可能存在多药耐药特性。常见的多药耐药的机制包括：多药耐药-1分子的高表达[5]、P-糖蛋白功能的激活[6]、细胞凋亡抑制蛋白[7]、细胞周期相关蛋白等表达异常[8]。然而重楼醇提物对化疗药耐药的原代细胞仍有较好的抗肿瘤作用，提示对于临床中顽固的恶性体腔积液可考虑重楼的抗肿瘤治疗。重楼与化疗药耐药的机制还需进一步研究。

　　凋亡抑制蛋白(IAP)survivin是一类高度保守的内源性细胞凋亡抑制因子[9]。survivin主要通过抑制死亡受体途径和线粒体途径共同通路的caspase家族抑制凋亡。本实验中我们研究了重楼醇提物对细胞系及相应的原代肿瘤细胞作用后对survivin mRNA 表达水平的影响，结果提示重楼醇提物作用72 h后可以使细胞系中survivin基因明显下调，同样结果也可见于部分原代肿瘤细胞中，但在不同细胞中基因下调的程度不同。

　　本文首次报道了重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的作用，并与化疗药的作用相比较，发现了重楼醇提物与化疗药交叉耐药的特性，并初步探讨重楼抗肿瘤的作用机制，为进一步的临床研究提供了参考。

　　【参考文献】

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