三氧化二砷对人宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用

　　作者：汤继英1,2， 潘东风1， 石小燕1， 王贤和1， 陈 萍1* 作者单位：(1郧阳医学院附属人民医院肿瘤科，湖北 十堰 442000;2湖北中医学院，湖北 武汉 430061)

　　【摘要】 目的：探讨三氧化二砷(As2O3)对人宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用及其机制。方法：MTT法确定As2O3对Hela细胞的半数致死浓度(ID50);克隆形成法观察20%ID50的As2O3对Hela细胞的放射增敏作用;流式细胞仪测定细胞周期。结果：细胞生长抑制率随As2O3浓度增加而增高; As2O3+照射组的细胞存活率、D0值和Dq值均小于单纯照射组(P<0.05);存活曲线肩区(Dq)变小，放射增敏比(SER)为1.39;As2O3和γ-射线均能使细胞阻滞在G2/M期，联合应用比单独应用抑制作用显著(P<0.01)。结论：As2O3对宫颈癌Hela细胞株有明显的放射增敏作用;可能与As2O3改变细胞周期有关。

　　【关键词】 三氧化二砷;宫颈癌;Hela细胞;放射增敏剂

　　Irradiation Enhancement of Arsenic Trioxide on Human Cell Line of Cervical Cancer TANG Ji-ying1,2,PAN Dong-feng1,SHI Xiao-yan1,WANG Xian-he1,CHEN Ping1* (1Department of Oncology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan,Hubei 430061,China)

　　Abstract: Objective To investigate the irradiation enhancement effect of arsenic trioxide on human cervical carcinoma Hela cells and its possible mechanism.Methods MTT assay was used to measure the survival rate of the cervical carcinoma Hela cells.Then the half inhibitory dosage (ID50)was calculated.Colony forming assay was carried out to take count of survival fraction.Cell survival curve was analyzed with Multi-target single-hit model and then sensitive enhancement ratio(SER) was calculated.Flow cytometry was performed to assess the influence of arsenic trioxide on cell cycle distribution. Results (1)Inhibitory effect of arsenic trioxide on cell proliferation was in a dose-dependent manner.(2)Cell survival rate was lower after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone,Dq and D0 value were decreased after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone(Dq :1.03 Gy vs 1.89 Gy, D0 :2.49 Gy vs 3.45 Gy),with SER being 1.39.(3)Both Gy 60Co -γ and 2μmol/L arsenic trioxide could arrest Hela cell to G2/M as assayed by flow cytometry.The inhibitory effect was much more obvious when arsenic trioxide and irradiation were combined than either of them was used alone. Conclusion Arsenic trioxide is able to enhance radiation effect obviously on human cervical squamous carcinoma Hela cells,which may be due to its regulation on cell cycle.

　　Key words:Arsenic trioxide;Cervical carcinoma;Hela cell;Radiosensitizer

　　宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，治疗以手术及放疗为主，lIa期以上多采用放疗。目前临床上提高肿瘤的放射敏感性主要利用化疗药物如顺铂、泰素等，但是由于化疗药物对正常细胞的毒性作用较大，且与放疗的副反应有协同作用，病人一般难以耐受。近年来研究发现许多中草药具有抗肿瘤、放疗增效等作用, 三氧化二砷(As2O3)就是其中的一种。As2O3是中药砒霜的主要成分，对卵巢癌、恶性胶质瘤、淋巴瘤等[1-3]肿瘤的放疗具有增敏效应，但其在宫颈癌方面的研究则较少。本研究拟观察As2O3对Hela细胞的放射增敏作用,并探讨其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人宫颈癌Hela细胞(武汉大学中南医院肿瘤研究所);亚砷酸氯化钠注射液(哈尔滨伊达药业有限公司，用生理盐水配制成1 mmol/L的储存液，4 ℃冰箱备用，使用前用培养液稀释至所需浓度);GWXJ80型60Co远距离治疗机;流式细胞仪(美国Beckman Coluter公司)。

　　1.2 细胞培养及照射条件

　　宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清RPMI-1640培养基中，并置于含5%CO2的37 ℃温箱中培养。60Co远距离治疗机室温下照射，γ-射线的剂量率40 cGy/min。

　　1.3 Hela细胞对As2O3药物敏感性测定

　　亚砷酸氯化钠注射液稀释至0.5、1、5、10、25、50 、75 、100 μmol/L 8个浓度，每个浓度设5个复孔，取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，接种于96孔培养板培养过夜(每孔1×l04个细胞，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液200 μL)，次日换液,加As2O3使其终浓度如上。培养48小时后每孔加入MTT(5 g/L) 20 μl，继续孵育4 h，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 200 μL，振动10 min后酶标仪检测波长为572 nm的吸光度值，计算细胞抑制率。抑制率=1-(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%，绘图后求半数致死剂量(ID50)值。

　　1.4 克隆形成法观察放射增敏作用

　　按放疗剂量0、1、2、4、6、8 Gy分为6个组，于25 cm2培养瓶中分别接种不同数量的细胞，每组设3个平行样本，每个剂量组分别设单纯照射(单放组)和照射+2 μmol/L As2O3(药放组)，待细胞贴壁后药放组加入As2O3，使其终浓度为20%ID50，24 h后接受照射，照射后24 h弃掉含药物的培养液，换含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，继续培养11～13 d后固定、染色，计数含50个细胞以上的克隆数。

　　存活分数的计算方法为：处理组克隆形成率/对照组克隆形成率，采用“多靶单击模型[4]”拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比(SER)。“多靶单击模型”方程：SF=1-(1-e-D/D0)N, Dq=D0㏒N，其中SF为细胞存活率，D为放射剂量(Gy)，D0代表平均致死量，Dq代表准域剂量，N为外推数。

　　1.5 细胞周期分析

　　将细胞接种于培养瓶中，分为空白组、As2O3组(单药组)、单纯照射(单放组)、照射+2 μmol/L As2O3(药放组)，每个组设3个平行样本，待细胞贴壁后药物干预组加药， 终浓度为2 μmol/L As2O3，24 h后单放及药放组接受2 Gy放疗，收集处理后的1.0×106个细胞用PBS清洗2次(1 500 r/min，5 min)，加入70%冷乙醇4 ℃固定过夜，清洗去除固定液，加入PBS 100 μL混匀细胞，再加入10 g/L RNAase 2 μL，充分混匀，置37 ℃水浴锅中加温30 min，加碘化丙啶(PI)染色液 (20 μg/mL)，常温避光30 min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，结果以细胞周期各时相细胞百分率表示。

　　1.6 统计学方法

　　所得数据以均数±标准差(x±s)的形式表示，Execl软件模拟细胞生长抑制曲线，SPSS 13.0软件模拟生存曲线并进行方差分析，以P<0.05为差别有显著性，以P<0.01为差别有极显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 Hela细胞对As2O3药物敏感性

　　细胞生长抑制率随As2O3浓度的增加而增大，绘图后求半数致死剂量(ID50)值10.86 μmol/L(见图1)。

　　图1 三氧化二砷对Hela细胞的生长抑制

　　2.2 As2O3对Hela细胞的放射增敏作用

　　放射剂量-细胞存活曲线见图2，多靶单击模型主要参数见表1。结果显示As2O3对宫颈癌Hela细胞有放射增敏作用，经药物处理后平均致死剂量(D0)降低，存活曲线肩区(Dq)变小。表1 照射后Hela细胞存活曲线主要参数

　　2.3 细胞周期分析

　　流式细胞仪检测细胞周期结果表明，放射及药物均能提高G2/M期的细胞比例，二者联合能显著提高效果(P<0.01)(见表2)。表2 As2O3与放疗对Hela细胞周期的影响(%)

　　3 讨论

　　As2O3是中药砒霜的主要成分，其临床适应症不仅仅局限于白血病的治疗，对实体瘤的临床应用研究也日趋增多。有关As2O3对细胞杀伤机制的研究大多与As2O3具有放射增敏效应有关[1-3]，但As2O3对宫颈癌放射增敏的研究报道甚少[5]。本研究利用 MTT法确定As2O3对宫颈癌细胞系Hela的细胞毒作用,证实细胞生长抑制随As2O3浓度的增加而增强，48 h半数致死剂量(ID50)值10.86 umol/L,说明As2O3与放射治疗联合对宫颈癌具有增敏作用。

　　“多靶单击模型”拟合经典的细胞存活曲线,其参数D0值为平均致死剂量,是一次照射能杀灭63%的细胞或37%细胞存活的剂量;Dq值是肩宽参数,它表明细胞亚致死损伤修复能力的大小,Dq值小表明细胞对亚致死损伤的修复能力较弱，本实验存活曲线参数亦证实了As2O3对离体宫颈癌细胞的放射增敏作用。提示As2O3通过抑制Hela细胞的修复而起到放射增敏作用。

　　有研究认为As2O3可以上调细胞周期蛋白B的表达，该蛋白是调节G2/M期转换的关键调控蛋白之一，可以促进Bcl-2磷酸化，从而导致G2/M期阻滞[6-7]。沈志忠等[8]认为As2O3作为一种巯基抑制剂，可能通过原浆毒作用与细胞内的巯基成分微管相交联，阻滞微管的形成与聚合，改变细胞内微丝的形态结构进而影响细胞周期，导致G2/M期阻滞，产生抗癌或抑癌作用。Liu Q等[9]认为As2O3可以导致胃癌CGL-2细胞DNA双链损伤，并且抑制DNA损伤的G2稽查点活化，使CGL-2细胞系阻滞于G2/M，可能进一步促进CGL-2系的凋亡。As2O3诱导细胞凋亡并促细胞阻滞于G2/M期在对多发骨髓瘤细胞及胃癌MKN45细胞系的研究中也得到证实[10-11]， 并且这种效应呈时间-剂量依赖性。本研究流式细胞分析结果显示放疗及As2O3均能致Hela细胞G2/M期阻滞，而G2/M的细胞对射线最敏感，因此As2O3诱导宫颈癌细胞周期阻滞可能是其放射增敏的机理之一，但长期应用As2O3是否会引起致癌、致畸等毒副作用则有待更深入研究。

　　(感谢郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所全体工作人员对本实验给予的指导与帮助!)

　　【参考文献】

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