白杨素的抗肿瘤作用

　　作者：王宇 周秀田 曹建国

　　关键词 白杨素;细胞增殖;细胞凋亡;抗肿瘤作用

　　流行病学调查证实食用一定量的蔬菜水果，茶可以降低癌症和心血管疾病的发生，黄酮类化合物在预防上述疾病中具有重要作用。黄酮类化合物是植物在长期自然选择中产生的一些次级代谢物，它们是一类以2-苯基色原酮(C6-C3-C6)为母核的多酚化合物(polyphenolic compounds).在发挥抗肿瘤活性时，均有A环与受体的负电荷中心结合，C环与受体的正电荷中心结合，其他部位通过氢键与受体发生作用的共性。白杨素因其主要存在于天然植物中且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的预防和治疗有重要意义。因此，白杨素的抗肿瘤作用引起了国内外医药科研工作者的兴趣。研究发现白杨素抗肿瘤作用主要表现在抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、消除活性氧、抑制血管增生、拮抗性激素等方面。

　　1 抑制肿瘤细胞增殖作用机制

　　1.1 抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)的活性 PTK是一组催化酪氨酸残基磷酸化的酶,通过从三磷酸腺苷(ATP) 转移一个γ-磷酸基到酪氨酸残基上使蛋白活化,进而参与细胞的信号转导，它的过量表达，扰乱了细胞内正常的信号传导，抑制细胞凋亡，引起细胞恶性增生，最终导致癌变发生。单纯bcr-abl 融合基因导致abl 基因所表达的PTK 活力持续升高,在恶性转化中起重要作用,可引发白血病[1]。 黄酮化合物是bcr-abl 蛋白相关的酪氨酸蛋白激酶的天然抑制剂，( 染料木黄酮,genistein)竞争性抑制激酶的ATP 结合位点,通过抑制Grb- 等受体蛋白质磷酸化,阻断bcr-abl蛋白介导的信号传导[2]。构效关系表明：C-5和C-7位有羟基或苯环上有三个羟基的黄酮化合物是PTK有效抑制剂，羟基被甲氧基取代活性消失，提示黄酮化合物作为氢供体和PTK之间可能起重要作用。由此可见，白杨素(5，7-二羟基黄酮)正是具有PTK抑制剂的结构特点。

　　1.2 抑制蛋白激酶C(PKC)的活性 近年来，越来越多的实验发现，蛋白激酶C与细胞凋亡存在密切的关系。蛋白激酶C对凋亡的控制主要是通过其在细胞核内的信号来实现的，在核中，尤其核质和染色体是蛋白激酶C优先作用的靶点。在增殖细胞和实体瘤细胞及某些造血系统的恶性肿瘤细胞中，可检测到蛋白激酶C在核中的含量及活性明显高于正常细胞。蛋白激酶C通过对一些癌基因或抑癌基因产物磷酸化作用而导致肿瘤的发生。有研究表明：白杨素(5，7-二羟基黄酮，CHR)是一些信号转录激酶的抑制剂可以抑制蛋白激酶C和酪氨酸蛋白激酶，从而发挥抗肿瘤作用。

　　1.3 增强抑癌基因表达和活性 过氧化物酶体增殖因子活化受体r(PPARr)具有多种生物学效应，它在脂肪细胞分化，脂，糖代谢，动脉粥样硬化中其重要作用。近年来人们还发现它参与细胞分化和细胞周期的调节。有资料表明PPARr抗肿瘤细胞增殖的作用在于抑制细胞周期[3]。通过激活PPARr使细胞周期蛋白D1,D2的mRNA表达下降，而P27mRNA的表达增加。研究证实食管癌细胞中存在PPARr表达，且使用PPARr激动剂可通过诱导食管腺癌细胞的凋亡和细胞周期停滞G1期，而阻止细胞的生长。此外，在前列腺癌，乳腺癌，脂肪肉瘤等恶性疾病中也观察到了相似结果。 由于在鼠单核巨噬细胞(RAW264.7) PPARr表达水平较低，在转PPARr质粒的RAW264.7细胞中，研究发现白杨素可以激活PPARr。影响其激活PPARr的能力的主要取决于羟基的数目和位置，位于A环5位和7位的羟基和B环4位的羟基有很强的激活能力。

　　1.4 细胞周期(cyclin depend kinase，CDK)的阻滞作用 细胞周期能否启动进行细胞增殖,主要调控点在G1期,它决定细胞是否通过G1期进入S期.细胞细胞周期的启动机制中,连接细胞信号传导与细胞细胞周期机制有两条途径:一是通过CyclinD-Cdk4/6, CyclinE-Cdk2。两者都是G1期进行的限速步骤,即CyclinD 或CyclinE的过度表达均能缩短G1期时间或加速G1期进行。研究表明,白杨素可以通过降低Cdk2和 Cdk4的活性、抑制酶蛋白体活化、诱导P21Waf1/Cip1表达,使鼠神经纤维瘤细胞系(C6)细胞阻滞于G1期(4)。

　　1.5 环氧合酶的抑制作用 Cox-2不仅是启动炎症反应的关键酶，而且还可以通过促进细胞增殖，抑制凋亡，促进肿瘤新生血管等机制参与多种肿瘤的发生和发展过程。事实上，Cox-2在多种肿瘤(包括肝癌、结肠直肠癌和胃癌中)的表达水平均显著增高，且使用Cox-2抑制剂，可有效的阻止肿瘤的发生，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。白杨素及其衍生物具有抑制鼠单核巨噬细胞(RAW264-7)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶(Cox-2)作用而发挥抗炎及抗肿瘤作用[5]，亦可通过与噻唑烷酮类化合物不同的方式激活过氧化物酶体增殖因子活化受体r(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARr)抑制iNOS和Cox-2活性而发挥抗肿瘤作用[6]。

　　2 诱导细胞凋亡作用

　　2.1. 激活Bcl-2途径 Bcl-2癌基因是通过阻止细胞凋亡的早期环节而发挥作用的,可阻止或降低细胞皱缩、染色质浓缩和DNA裂解的发生[7]。Bax基因与Bcl-2癌基因具有40%的同源性,但作用却与Bcl-2癌基因相反,起着加速细胞死亡的作用。研究发现,细胞中的Bax蛋白可自身形成同源二聚体,也可以和Bcl-2蛋白形成异源二聚体。当Bcl-2蛋白以同源二聚体的形式存在时,细胞趋于存活;但如果Bax大量表达并与Bcl-2蛋白形成异源二聚体或自身形成同源二聚体时,则细胞趋于死亡。Bax过表达能对抗Bcl-2抑制细胞死亡的活性,在促凋亡因素刺激下,Bcl-2/Bax比值将决定细胞的死活。有研究表明，白杨素及其衍生物可通过与噻唑烷酮类化合物不同的方式激活过氧化物酶体增殖因子活化受体r(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARr)，从而调节Bcl-2家族蛋白的表达，(Bcl-2下调，Bax上调)Bcl-2/Bax比值下降，促进细胞死亡，发挥抗肿瘤作用[8]。

　　2.2 抑制NF-ΚB信号传导通路 研究发现, NF-kB过度激活与许多病毒与非病毒的恶性肿瘤有关,如肝癌、肺癌等, NF-kB导致肿瘤的发生是因为细胞因子或其受体基因转录的激活,阻断了凋亡。其次,NF-kB活化可直接作用于DNA复制或具有促进CyclinD1表达及G1/S转录功能使细胞过度增殖导致癌症的发生。NF-kB上调TRAF1和TRAF2的表达,阻断caspase-8的激活,诱导Bcl-2。基因表达和抑制Bax基因表达[9]。NF-kB还可以上调CyclinD1的转录,使细胞周期进入S期,促进细胞生长,发挥其对抗凋亡的功能。Blonska等报道，在鼠单核巨噬细胞(RAW264-7)中，白杨素可以通过强烈抑制IkB的降解，降低脂多糖(LPS)诱导的NF-kB在核内的表达。

　　2.3 抑制PKB/Akt信号传导 PKB/Akt能够促进细胞生长，使锚定不依赖生长能力增加，S期细胞增多，抑制细胞p27Kipl表达，抑制细胞失巢凋亡。有研究表明超表达 PKB/Akt可以使细胞发生转化[10],在不同的肿瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌和乳房癌等均发现PKB/Akt的过度表达[11],提示 PKB/Akt 在肿瘤细胞异常行为中起重要的作用。众所周知，Bcl-2，Bcl-Xl等蛋白可促进细胞生长，而Bad，Bax等则促进细胞死亡。Bcl-2家族同质二聚体或异质二聚体的形成及平衡被认为是决定细胞死亡与生存的关键。Bad是PKB的直接底物，PKB是强有力的Bad-Ser136激酶。PI3K依赖性的PKB的激活，可以使Bad-Ser136位点磷酸化，有效阻止Bad诱导的细胞死亡。实验显示，在U937白血病细胞中，通过PI3K抑制剂LY294002有效的抑制了Akt的磷酸化，促进了U937白血病细胞的凋亡[12]。

　　2.4. 激活 Caspase-3(Cpp32) Caspase 是一个半胱氨酸蛋白酶家族, Caspase-3又称半胱氨酸蛋白酶-32(cysteine protease P32)在细胞凋亡的过程中起着关键性作用。细胞凋亡的发生是一个复杂的Caspase 家族引导的蛋白酶级联反应过程,尽管对于不同的细胞或不同信号传导途径诱发的凋亡过程中参与的Caspase 有所不同,但Caspase-3 是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路,也是凋亡的关键酶和执行者。基因剔除实验和动物模型显示,阻断Caspase 活性即阻滞了体外和体内的细胞凋亡。Monasterio A等应用FCM分析法和寡核苷酸DNA片段分析法发现白杨素通过激活Caspase-3和Caspase-8，而不是Caspase-9途径抑制人白血病细胞U937增殖。

　　3 消除活性氧的作用

　　已经证实,自由基与人的病理(肿瘤、炎症、动脉粥样硬化等)、生理(衰老)有密切关系。许多致癌因子导致自由基在体内聚集，引起脂质细胞过氧化使细胞DNA解链断裂，从而引起癌症。

　　构效关系表明：黄酮类化合物抗氧化的作用机制是通过酚羟基与自由基反应生成共振稳定的半醌式自由基结构，从而终止自由基链式反应。5，7-位羟基有利于此活性，易于与过渡金属离子络合，且7-位羟基有较强的酸性，这些都有利于抗氧化活性。

　　通过药理活性分析，白杨素可以清除由中性粒细胞和巨噬细胞所产生的自由基，抑制NO产物形成，还可以抑制COX和脂加氧酶途径。Sloley BD等研究发现白杨素在体外能显著抑制鼠脑单胺氧化酶(MAO-A，MAO-B)活性。Shimizu K在直肠癌(Caco-2)和肝癌(HepG2)细胞研究中发现白杨素等黄酮类化合物能保护氧化损伤和抑制脂质过氧化反应，呈剂量依赖性。

　　4 抑制肿瘤新生血管形成

　　近年来研究证明，内源性NO具有广泛的生物活性，既是细胞信使分子又是毒性分子。大多数实验性肿瘤组织中均可见iNOS的升高，产生的NO可以增加血管通透性，加速肿瘤组织的营养供应，促进肿瘤快速生长和转移。肿瘤生长和侵袭转移的基础是新生血管的形成。NO作为肿瘤细胞信号转导途径中重要的信使分子,调节与细胞增殖相关基因的表达,能增加肿瘤血供和血管形成,促进其生长、侵袭与转移。NO 通过增加血管通透性不但为肿瘤细胞提供了营养物质和氧气,而且通过血管内物质外渗,促进了血管内皮细胞的增殖、移行及肿瘤细胞的转移 。有实验证实，白杨素在转录水平发挥作用，在鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)iNOmRNA表达明显降低，且这一作用呈量效依赖关系。

　　5 拮抗雌激素作用

　　雌激素与许多肿瘤的发生有着密切的关系，如子宫肉瘤，子宫内膜癌，宫颈癌，乳腺癌等。研究发现白杨素可以通过抑制芳香酶的活性来发挥抗雌激素的作用，从而降低乳腺癌的发生率。

　　另外，有研究表明，白杨素能诱导人肝细胞癌(HepG2)细胞和人直肠癌(Caco-2)细胞尿苷酸二磷酸一葡萄糖醛酸转移酶(UDPGTs)的表达和活性。抑制致癌物质PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯唑吡啶)诱导基因突变而发挥抗基因突变作用。白杨素显著抑制人甲状腺癌细胞生长;Habtemayiam，等实验研究显示：白杨素通过调控肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达诱导人肝癌细胞凋亡。

　　6 前景与展望

　　近年来，从天然植物成分中筛选有抑癌作用的化合物，是国内外医药学者的研究热点。虽然白杨素具有抗氧化，抗病毒，抗高血压，抗肿瘤，抗刺激素等作用，但因其肠道吸收甚少和5,7位羟基被迅速糖基化代谢导致活性降低，从而影响了白杨素的临床应用。为此，对其生物学效应应进行全面综合评价，对其结构进行有效的修饰以及作用机制的深入探讨，以期获得高效低毒的新型抗肿瘤侯选药物具有重要意义。我国是一个具有丰富中草药资源的国家，充分开发白杨素为人类服务是我们的优势。

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　　作者单位 长治医学院病理科(046000) 南华大学肿瘤研究所