环氧化酶-2VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

　　作者：牛艳清　于建宪

　　【摘要】 目的:观察环氧化酶-2(COX-2)、VEGF在NSCLC及非肿瘤性病变肺组织中的表达，探讨其在NSCLC发生发展及肿瘤血管生成中的作用。方法:制作71例NSCLC和21例非肿瘤性病变肺组织共92例的组织芯片，采用免疫组化技术检测COX-2、VEGF的表达。结果:①COX-2、VEGF在NSCLC组织中的阳性表达率分别为77.47%、77.06%，均显著高于非肿瘤性病变肺组织(14.29%，38.10%)。COX-2的表达与肺癌组织的病理类型有关;VEGF的表达与肿瘤大小、淋巴结转移与否有关。②NSCLC组织中COX-2与VEGF表达具有相关性。结论:①COX-2和VEGF在NSCLC的发生、发展、转移过程中发挥调控作用，可作为判断NSCLC转移和预后的重要生物学指标。②COX-2可能通过调节VEGF的表达参与NSCLC组织中血管生成。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;COX-2;血管内皮细胞生长因子;组织芯片

　　研究发现环氧化酶-2(COX-2)在多种肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤血管形成，由COX-2催化合成的前列腺素可能作为血管生成剂促进肿瘤的形成。在人前列腺癌组织中发现COX-2与VEGF表达基本一致，而其增高幅度与肿瘤恶性程度相关 [1] 。本研究旨在探讨COX-2与VEGF在

　　人非小细胞肺癌组织中的表达、意义及相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 研究对象:收集选择青岛市立医院胸外科2004年1月～2005年10月间手术切除非小细胞肺癌标本73例(术前均未行放、化疗)及肺良性疾病21例作为组织对照，所有标本均经病理检查证实并取自病变的典型区域。其中NSCLC病理组织学诊断及分级采用WHO1999年肺癌组织学分类、分级标准 [2] ，分期采用1997年国际抗癌联盟(UICC)制定的肺癌临床分期标准 [3] 。所有标本均及时经10%中性福尔马林固定，熔点为56℃～58℃的石蜡包埋。

　　1.1.2 研究材料:鼠抗人VEGF单克隆抗体购自Santa Cruz公司，鼠抗人COX-2单克隆抗体、PV9000通用型免疫组化检测试剂盒、非免疫小鼠IgG均购自北京中杉公司。每批实验均分别取COX-2、VEGF阳性片作阳性对照，并分别用同种动物非免疫血清代替一抗作阴性对照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织芯片的制作:①观察每一组织标本的HE切片以确定蜡块穿刺位置;②用Beecher Instru-ments生产的组织芯片仪，从蜡块标记部位逐个取出2mm组织芯，随即推入受体蜡块上已打好的孔内，制作成组织芯片蜡块;③将制作好的组织芯片蜡块面向下置于模具中，60℃烤箱中放置1h，使蜡块重新熔为一体。随后将蜡块连同模具一同取出，静置自然冷却至室温，然后置于-4℃冰箱中7min，将蜡块与模具剥离;④将制作好的组织芯片蜡块3μm～4μm连续切片，冷水漂片，挑选组织芯完整的切片转移至56℃水中展片，用预先制备好的APES载玻片捞片。

　　1.2.2 组织芯片免疫组化标记:主要步骤为:①组织芯片切片常规脱蜡至水;②内源性过氧化物酶阻断;③组织微波抗原修复;④滴加适当稀释的一抗(其中COX-2:1∶600稀释，VEGF:1∶300稀释)，湿盒内冰箱中4℃过夜;⑤分别滴加试剂1、试剂2，均在湿盒内37℃孵育20min;⑥DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

　　1.3 结果判定

　　COX-2、VEGF免疫组化染色结果判断标准采用Kim [4] 阳性细胞半定量积分法:光镜下分析， 在排除非特异性染色的前提下，A以切片中阳性细胞染色强度分级，0级:阴性;1级:弱阳性;2级:中等强度阳性;3级:强阳性。B以切片中阳性细胞比例评分，染色的范围标记为0(0)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)、4(76%～100%);两积分相加之和作为最后的染色积分，其积分≥2认为阳性，其余均为阴性。

　　1.4 统计学分析

　　应用SPSS软件包11.5进行数据处理，以P<0.05确定差异有显著意义。

　　2 结果

　　2.1 组织芯片的质量本研究制成2个组织芯片蜡块，蜡块完整，肉眼可见组织芯排列整齐，外形为圆形或类圆形，无缺损现象。芯片HE染色结果:点阵分布均匀，组织芯完整，只有2例组织芯缺失不全，1例组织芯出现移位，为统计方便取有效例数92例(其中NSCLC组71例、对照组21例)，有效率为97.87%，仍可代表原样本信息，不影响统计学分析。71例NSCLC病例中男性53例，女性18例;年龄38岁～81岁，平均年龄62.3岁;鳞状细胞癌38例(高分化1例，中分化22例，低分化15例)，腺癌31例(高分化12例，中分化13例，低分化6例)，巨细胞癌2例;发生淋巴结转移33例;Ⅰ期36例，Ⅱ期23例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例。

　　2.2. COX-2、VEGF在两组组织中的表达及其与NSCLC患者临床病理特征的关系COX-2蛋白阳性染色主要定位于胞浆，为清晰棕黄色弥漫性分布，强阳性组可见明显的颗粒状着色。COX-2在NSCLC组织中的阳性表达率及与患者临床病理特征的关系见表1、表2。

　　表1 NSCLC、非肿瘤性病变肺组织中COX-2、VEGF的表达　略

　　表2 NSCLC中COX-2、VEGF的表达与临床病理特征的关系 (略)

　　VEGF蛋白阳性染色主要定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状，以肿瘤组织周边部位及坏死区域周围肿瘤细胞表达较强，肿瘤组织内巨噬细胞、成纤维细胞及部分血管内皮细胞也呈阳性。VEGF在NSCLC组织中阳性表达率及与患者临床病理特征的关系见表1、表2。

　　2.3. NSCLC组织中COX-2与VEGF的关系 (见表3)

　　表3 COX-2与VEGF在NSCLC组织中表达的相互关系　略

　　在NSCLC组织中COX-2表达阳性的55例组织中VEGF表达阳性的有46例(占83.64%)，而COX-2表达阴性的16例组织中VEGF表达阳性的仅有8例(占50.00%)，经四格表χ 2 检验COX-2与VEGF表达密切相关(P<0.05)。

　　3 讨论

　　环氧化酶(COX)是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，其中COX-2亚型为可诱生型，在正常生理状态下多数组织内检测不到，而在一定因素如生长因子、炎症介质、促癌剂及一些癌基因产物等刺激下表达增加。本实验应用组织芯片技术免疫组化染色检测71例NSCLC组织、21例非肿瘤性病变组织中COX-2的表达水平，发现COX-2在NSCLC组织中阳性表达率为77.46%，显著高于非肿瘤性病变组织。并在组织切片中观察到，NSCLC组织中分布的部分增生腺体也可见COX-2高表达，而在正常肺组织内的腺体少有表达，因此认为COX-2与肺癌的发生发展密切相关。目前国内外报道肺癌组织中COX-2的表达与淋巴结转移及TNM分期关系的结果尚不一致，虽然本实验中未发现COX-2的表达水平与淋巴结转移及TNM分期相关，但这并不足以否定其参与肺癌的浸润转移。Kozaki等 [5] 用高转移肺癌细胞系实验显示，COX-2表达与肿瘤侵袭转移能力呈正相关，其抑制物可减少肺转移，同时还观察到转移肺癌细胞内多种炎性介质及促血管生成物质增加，认为肺癌细胞可能在转移过程中利用COX-2参与炎症过程，类似炎症细胞穿越血管壁，从而促进肺癌血行转移。我们的研究中发现COX-2表达与淋巴结转移无关，但在肺腺癌组织中显著高表达，表明COX-2的高表达可能在肺腺癌的早期即已发挥促进癌细胞血行转移的作用，而未参与淋巴转移途径，这与肺腺癌血行转移较早而淋巴转移较晚的临床特点相一致。

　　血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前被认为诱导血管形成最重要的生长因子。VEGF由许多肿瘤细胞释放，在原位肿瘤细胞中表达，特异地作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，介导血管形成。本实验71例NSCLC中VEGF阳性率为76.06%，显著高于非肿瘤性病变组织，表明VEGF的表达与肺癌的发生有关。本实验结果显示VEGF表达仅与肿瘤大小、淋巴结转移具有相关性，在肿瘤直径大于3cm及淋巴结有转移的NSCLC组织中VEGF表达更显著，阳性率更高，表明VEGF与NSCLC的生长、转移有关。

　　多项研究表明肿瘤细胞中COX-2的过度表达与新生血管的形成有关，在多种恶性肿瘤中COX-2和VEGF表达存在相关关系，而其增高幅度与肿瘤恶性程度相关 [1，6，7] 。本实验结果也显示COX-2与VEGF存在相关性，提示COX-2可能通过调节VEGF的表达来促进非小细胞肺癌新生血管的形成。我们分析其中的机制可能有两方面，①COX-2催化花生四烯酸的代谢产物PGE 2 、PGI 2 、TXA 2 等可直接促进血管内皮细胞的移位和生长因子诱导的血管形成 [8] 。②增加促血管生成因子，如VEGF的表达。COX-2催化产物前列腺素与相应受体结合，通过cAMP和cAMP依赖蛋白激酶(PKA)途径诱导VEGF的表达 [9] 。Williams等 [10] 将Lewis肺癌细胞植入COX-2基因缺乏的小鼠体内，观察到血管生成和肿瘤生长均受抑制，提示COX-2通过上调VEGF的表达从而促进血管生成。但Tamura等发现VEGF可以诱导人微血管内皮细胞COX-2和PGE 2 的表达，且这种作用 可以被选择性COX-2抑制剂NS398抵消 [11] 。这些研究进一步支持COX-2和VEGF之间存在密切关系，但是两者之间究竟是何种正反馈机制有待于更深入的研究。

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