磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在胃癌组织中的表达

　　作者：徐大志， 夏良平， 林桐榆， 蔡木炎， 范新娟， 詹友庆， 周志伟， 李威 作者单位：1. 华南肿瘤学国家重点实验室//中山大学肿瘤防治中心， 广东 广州 510060;2. 中山大学附属第六医院病理科， 广东 广州 510655

　　【摘要】 【目的】 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在多种肿瘤组织中均有表达，但其与胃癌关系的研究国内尚无报道。本研究旨在检测中国人胃癌组织中mTOR的活化形式p-mTOR的表达，并探讨其与胃癌临床病理特征的关系。 【方法】 采用免疫组化方法检测181例胃癌组织中p-mTOR蛋白的表达情况，并结合患者的临床病理资料分析与其相关性。 【结果】 所检测的181例胃癌标本中p-mTOR蛋白表达阳性93例，阳性表达率为51.4%，p-mTOR阳性表达与胃癌的淋巴结转移及临床分期密切相关;而与年龄、性别、肿瘤大小、病理T分期等临床病理特征无显著性相关(P > 0.05)。 【结论】 p-mTOR蛋白在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤进展相关，可能成为预测胃癌转移的新分子标志物和治疗靶点。

　　【关键词】 胃癌; p-mTOR; 免疫组化

　　Expression and Clinical Significance of p-mTOR in Gastric Cancer

　　XU Da-zhi1， XIA Liang-ping1， LIN Tong-yu1*， CAI Mu-yan1， FAN Xing-juan2，

　　ZHAN You-qing1， ZHOU Zhi-wei1， LI Wei1

　　(1. State Key Laboratory of Oncology in South China∥Cancer Center of SUN Yat-sen University， Guangzhou 510060， China;

　　2. Department of Pathology， The Sixth Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510655， China)

　　Abstract： 【Objective】 mTOR is widely expressed in many kinds of tumors. But its expression has not been reported in gastric cancer tissues. This study was to investigate the expression and clinical significance of p-mTOR in gastric cancer. 【Methods】 The expression of p-mTOR was detected in the specimens of 181 gastric cancers by immunohistochemistry. The correlation of p-mTOR expression to clinicopathologic features of gastric cancer was analyzed. 【Results】 The positive rate of p-mTOR in gastric cancer was 51.4%， closely correlated with lymph node status and pTNM stage (P < 0.05)， but not correlated with age， sex， tumor size， Borrmann type， and pathologic T classification (P > 0.05). 【Conclusion】 The expression of mTOR actived is related to gastric cancer progression. The p-mTOR may be served as a new molecular marker and potential target for anticancer therapy.

　　Key words： gastric cancer; p-mTOR; immunohistochemistry

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(3)：304-307]随着分子生物学的不断发展，靶向治疗已成为肿瘤治疗的主要方向，但胃癌的靶向治疗仍处于探索阶段，缺乏有效的靶点。目前认为，mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路的调控异常与肿瘤发生密切相关，正成为肿瘤靶向治疗的热点[1]，但它在胃癌方面报道较少。本实验旨在研究胃癌组织中mTOR的活化形式磷酸化的mTOR(p-mTOR ser2448)在胃癌组织中的表达，并分析它与胃癌临床病理特征的关系，以探讨其作为胃癌潜在治疗靶点的可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料

　　1.1.1 资料入选标准 收集中山大学肿瘤防治中心腹科1997年1月至2002年12月间胃癌手术病例181例。全部病例满足以下条件：①全部病例术前均经病理确诊。②所有患者均行根治性手术。③有完整的临床资料。

　　1.1.2 临床及病理特征 男性129例，女性52例;年龄23 ～ 83岁，中位年龄59岁;大体分型：早期胃癌7例，BorrmannⅠ型 4例，BorrmannⅡ型65例，BorrmannⅢ型101例，BorrmannⅣ型4例;根据国际抗癌联盟(UICC)2002 TNM分期方法Ⅰ期26例，Ⅱ期47例，Ⅲ期100例，Ⅳ期8例 (表1) 。

　　1.2 试剂与方法

　　实验主要试剂兔抗人p-mTOR(ser2448)单克隆抗体，购于美国Cell Signaling Technology公司。采用免疫组化EnVision方法，免疫组化染色按试剂盒操作说明进行，兔抗人p-mTOR(ser2448)单克隆抗体稀释浓度1 ∶ 10。石蜡包埋组织切片厚3 μm，经脱蜡、水化，按要求进行抗原修复后，切片常规脱蜡冲洗后，置10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)高压修复抗原，过氧化物酶和小牛血清先后处理，Ⅰ抗室温孵育1h，分别滴加Ⅱ、Ⅲ抗，DAB显色。用PBS液代替一抗作为阴性对照，前列腺癌标本作阳性对照。

　　1.3 判断标准

　　p-mTOR蛋白主要位于细胞浆，部分位于细胞膜，阳性者可见细胞浆染色为棕黄色颗粒。p-mTOR的评分标准参考文献[2]，在阳性细胞显示区域，每个病例计数至少100个肿瘤细胞。以上结果均至少由两位病理科医生以盲法观察确定。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，采用χ2 检验、Spearman 秩相关分析各组指标结果与临床病理关系， P < 0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 p-mTOR在胃癌组织中的表达

　　181例胃癌组织中有93例表达为阳性，阳性率51.4%，阳性信号主要位于胃癌细胞浆内。p-mTOR蛋白在胃癌组织中的表达见图1。

　　2.2 p-mTOR在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系

　　本研究淋巴结阳性的胃癌病例137例，其中78例p-mTOR表达阳性，占56.9%，淋巴结阴性的胃癌病例44例，其中15例表达阳性，阳性表达率为34.1%，经统计学分析，两组中p-mTOR阳性率有显著性差异(P = 0.008)。

　　本研究临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的胃癌标本分别为26、47、100、8例，其中p-mTOR阳性表达分别为9、19、59、6例，分别占34.6%、40.4%、59.0%、75.0%(P = 0.026)。本研究中，p-mTOR的表达在不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、Borrmann分型、肿瘤分级、浸润深度等差异无统计学意义。

　　3 讨 论

　　mTOR 是雷帕霉素(rapamycin)的靶分子，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。它处于PI3K/Akt/mTOR 信号通路的下游，一方面接受来自上游的信息，如细胞外生长因子，细胞外营养素等的刺激;另一方面，mTOR将信息进一步传递给下游，影响细胞周期的进展，导致细胞分化[1，3]。PI3K/AKT途径在肿瘤中被激活后可使细胞周期调节失控，引起细胞转化和肿瘤进展[4]。许多肿瘤中存在有编码mTOR信号通路相关蛋白的基因突变，这些蛋白的表达异常可引起mTOR通路的过度激活[5-6]。研究表明，乳腺癌、白血病、胃肠道间质肿瘤、肝细胞癌、肺癌等均存在PI3K/AKT/mTOR 信号通路的失调[7-8]。

　　由于mTOR是肿瘤发生过程中的一个关键因子，p-mTOR是mTOR的激活形式，检测p-mTOR更能反应mTOR通路的激活状态，因此成为了肿瘤治疗中的一个重要靶点。国外已有报道，它在许多肿瘤组织中呈现高表达，如胆管癌[2]、乳腺癌[9]、肾癌[10]等。

　　目前，p-mTOR在胃癌中的研究较少。已有研究表明，p-mTOR在胃癌的发生、发展中呈现过度表达[11]，提示mTOR的激活在胃癌的发生中起到一定作用。本研究中，我们发现其过度表达率为51.4%。而Lang等[12]报道，p-mTOR在胃癌中的表达率则高达62.1%，与我们的结果有所差异。这种不一致，可能是样本量不同所致，因Lang研究组仅检测了58例胃癌标本。另外，结合东西方胃癌在淋巴结清扫、辅助化疗等治疗模式上的争议，我们推测东西方胃癌的生物学行为也可能存在不同，从而导致p-mTOR在两者胃癌中表达的差异。

　　本实验研究显示，p-mTOR在胃癌淋巴结转移阳性患者的肿瘤组织表达率明显高于淋巴结阴性的病人，提示mTOR的激活在胃癌的淋巴结转移中起到一定作用，预示肿瘤具有高度淋巴结转移潜能。Lang等[12]通过实验研究也发现，p-mTOR在胃癌中的表达与淋巴管浸润密切相关，与我们的结论一致。这提示在临床上，对于那些p-mTOR蛋白阳性表达的胃癌病例，即使术中未见有明显的淋巴结转移，也要进行严格的淋巴结清扫，从而可能改善其预后。

　　在p-mTOR蛋白与临床病理特征之间关系的分析中，我们进一步发现，不同TNM分期p-mTOR的表达有明显的差异，Ⅲ-Ⅳ期胃癌组织中的p-mTOR蛋白阳性表达要明显高于在Ⅰ-Ⅱ期的表达。我们在前期的研究已证明[13]，淋巴结转移和临床分期均与胃癌的诊治和预后关系密切，临床分期高或出现淋巴结转移的患者多数预后不良。所以，mTOR的激活在肿瘤的发展、转移过程中起了一定作用，p-mTOR的测定对于胃癌的治疗可以提供积极的指导作用。

　　在胃癌的实验研究中，已有研究[1]显示，p-mTOR的抑制剂雷帕霉素及其衍生物CCI-779、RAD001和AP23573具有抗癌作用，且安全性好，副作用少。孙丹凤等[14]研究认为，雷帕霉素干预后可使胃癌细胞生长抑制，随着时间增加抑制效应更显著，证实mTOR信号通路在胃癌细胞中也发生改变，可能成为一种潜在的治疗靶点。Lang等[12]也发现，在胃癌的动物实验中，雷帕霉素可以抑制其转移瘤的生长。因此，p-mTOR有望成为肿瘤靶向治疗的有效靶点。

　　本研究结果表明，p-mTOR可能在胃癌发生淋巴结转移和肿瘤进展时起到重要作用，p-mTOR可能成为预测胃癌淋巴结转移和肿瘤进展的新分子标志物以及靶向治疗的有效靶点。由于本研究病例数有限，且仅限于免疫组化单方面的结果。p-mTOR能否最终成为预测胃癌淋巴结转移的新分子标志物和治疗靶点，有待进一步研究证实。

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