苯丁酸钠联合奥沙利铂对结肠癌细胞HT29的凋亡作用

　　作者：莫正英1,2, 梁清乐2, 戴冀斌1* 作者单位：(1武汉大学医学部基础医学院,湖北 武汉 430071;2郧阳医学院附属太和医院肿瘤科,湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的：探讨苯丁酸钠(SPB)联合奥沙利铂(LOHP)诱导HT29细胞的凋亡作用及其机制。方法：结肠癌HT29细胞分为空白对照组、奥沙利铂组、苯丁酸钠(1 mmoL/L)+奥沙利铂组、苯丁酸钠(2 mmoL/L)+奥沙利铂组，MTT法测定各组细胞存活率，流式细胞仪检测凋亡率;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白Caspase3和核转录因子NKκB的表达。结果：苯丁酸钠能降低奥沙利铂诱导的HT29细胞存活率，随着其浓度增高，细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01)，细胞中Caspase3蛋白和NKκB蛋白表达则逐渐降低(P<0.05)，均呈浓度依赖性。结论:苯丁酸钠(SPB)联合奥沙利铂(LOHP)可诱导HT29细胞凋亡，其机制可能与抑制Caspase3和NKκB信号传导通路有关。

　　【关键词】 HT29细胞;苯丁酸钠;奥沙利铂;Caspase3;NKκB

　　The Mechanism of Sodium Phenylbutyrate Enhances Apoptosis of HT29 Cells Induced by Oxaliplatin MO ZhengYing1,2，LIANG Qingle2，DAI Jibin1* (1School of Basic Medicial Science,Medicine Division,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430030 China;2Department of Oncology,TaiHe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:objective To investigate the effects of sodium phenylbutyrate on oxaliplatin induced apoptosis in HT29 cells and its mechanism. Methods The HT29 cells were divided into four groups,Cell viability was tested by MTT assay and apoptotic ratio were measured by flow cytometry.The expressions of Caspase3 and NKκB proteins were tested by Western Blotting. Results The different concentrations of SPB inhibited the cell viability and enhanced the apoptosis based on LOHP induced HT29 cells.The level of Caspase3 and NKκB were decreased with the SPB concentration rising.There was concentration dependent of the SPB.Conclusion SPB can enhance LOHP induced apoptosis in HT29 cells and inhibit the expression of Caspase3 and NKκB which might be the possible signaling pathway of inducing apoptosis.

　　Key words:HT29 cells;Sodium phenylbutyrate;Oxaliplatin;Caspase3;NKκB

　　奥沙利铂(oxaliplatin，LOHP)是继顺铂、卡铂之后的第三代新型铂类抗肿瘤化合物，对多种肿瘤具有显著活性，临床广泛应用于结肠癌的治疗，但长期应用其毒副反应较大[1]。研究发现，肿瘤细胞中组蛋白乙酰化状态的失衡与肿瘤的发生密切相关，一些组蛋白去乙酰化酶抑制剂被陆续研制出来，苯丁酸钠(SPB)作为其中的一种，具有高效、低毒、可抑制多种肿瘤细胞生长等特点。本研究用苯丁酸钠(SPB)联合小剂量奥沙利铂(LOHP)共同作用于结肠癌细胞HT29，通过观察其体外相互作用，以探讨其可能的分子机制，为临床联合用药提供可能方案。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人结肠癌HT29细胞(武汉大学细胞典藏中心)，RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亚砜(DMSO,SIGMA公司)，酶联免疫检测仪(BIORAD550，美国伯乐公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)。

　　奥沙利铂(oxaliplatin，LOHP)由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，生理盐水配成储存液，-20 ℃保存。苯丁酸钠(SPB)购自德国ALEXIS公司，以RPMI 1640培养液配制成储存液，-20 ℃保存。一抗羊抗人Caspase3和兔抗人NKκB (Santan Cruz 公司)。二抗(辣根过氧化物酶HRP标记的抗羊和抗兔抗体 1∶5000)。

　　1.2 细胞培养及分组

　　将HT29细胞置37 ℃、5%CO2孵箱中,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养。2～3 d换液，取对数生长期细胞。将培养的HT29细胞分为4个组，分别为： 空白对照组(A)、奥沙利铂(60μmoL/L)组(B)、苯丁酸钠(1mmoL/L)+奥沙利铂(60 μmoL/L)处理组(C)、苯丁酸钠(2 mmoL/L)+奥沙利铂(60 μmoL/L)处理组(D)。

　　1.3 MTT法测细胞存活率

　　96孔板接种细胞，每孔104个，每组3个重复。24 h细胞完全贴壁后吸出培养液，加入上述各实验药物处理HT29细胞24 h，实验终止前4 h加入MTT液20 μL/孔，实验结束后吸取培养液，每空加入150 μL DMSO,平板震荡10 min，酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定各孔吸光度OD值。

　　1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

　　将各组细胞以5×105个/孔接种于6孔板，制成单细胞悬液，离心5 min，弃上清，沉淀物用PBS洗2次。调整细胞浓度为2～5×105/mL，加入5 μL Annexin VFITC 染色液，混匀，室温下避光孵育15 min，冲洗，加入5 μL PI，避光孵育5 min，每个样品以流式细胞仪采集约10 000个细胞，30 min内上机检测凋亡细胞百分比。

　　1.5 Western blotting检测蛋白表达

　　细胞经培养后用冷PBS 洗3次，加入200 μL细胞裂解液，混匀，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心20 min，收集上清。每个样本加入等体积加样缓冲液混匀，煮沸10 min，冷却后测定蛋白含量(BCA法)。

　　按测定结果每孔上样40 μL，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转至PVDF膜上，室温封闭2 h，孵育一抗(1∶1 000稀释)4 ℃过夜。TBST漂洗10 min×3次，二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST漂洗10 min×3次。DAB显色，扫描，以βactin 作为内参。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS 13.0数据处理软件进行统计学处理，单因素方差分析，两两比较采用q检验，以P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞的存活率和凋亡率

　　奥沙利铂组(1.32±0.17)细胞的吸光度较空白对照组(1.56±0.12)低，但无统计学意义(P>0.05);而1 mmol/L和2 mmol/L LOHP联合SPB组细胞吸光度分别为(0.75±0.11)、(0.51±0.13)，较奥沙利铂组明显下降(P<0.05)。

　　奥沙利铂组细胞凋亡率(9.32±0.96)%较空白对照组(2.15±0.42)%高(P<0.05)，1 mmol/L 和2 mmol/L LOHP联合SPB作用后，细胞的凋亡率分别为(18.25±4.17)%、(40.17±9.35)%，细胞的凋亡率随SPB浓度上升而提高(P<0.01)，高浓度LOHP组较低浓度组更为显著(P<0.05)。

　　2.2 凋亡相关蛋白Caspase3和NKκB的表达

　　由图1看出，LOHP组单独作用于HT29细胞时，Caspase3和NKκB电泳条带灰度较对照组浅，随着1 mmol/L和2 mmol/L LOHP联合SPB作用，其灰度逐渐减弱;图2显示与βactin比较，其比值随LOHP浓度增加而降低(P<0.05)。

　　3 讨论

　　奥沙利铂又名草酸铂，属于新型铂类衍生物，其结构是立体异构体，通过产生烷化结合物作用于DNA形成链内和链间交联而抑制DNA的合成及复制，是继顺铂、卡铂之后的第三代新型铂类抗肿瘤化合物，也是迄今为止对结肠癌具有显著活性的铂类药物，但其剂量积累性限制了其长期应用。研究发现几乎每种类型的肿瘤发生学都涉及到相关基因的表观遗传学改变，而这种改变是可逆的，因此逆转肿瘤的表观遗传学紊乱、重新激活由于脱乙酰化而沉默的基因，从而发挥其介导的抗肿瘤效应已成为肿瘤防治的重要策略[2-3]。

　　苯丁酸钠作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂是抗肿瘤化疗新药，体内和体外的实验证实其能够诱导细胞凋亡[4-6]。由于肿瘤本身是一种多因素、多步骤、多基因改变的疾病，每种药物均只能针对一种或几种靶分子起作用，如果将多种抑制剂联合应用可能会使药物发挥更好的效果，联合用药将成为医学肿瘤学的发展趋势。

　　本实验发现，苯丁酸钠呈剂量依赖性增强奥沙利铂对HT29细胞的抑制作用，二者联合可明显促进细胞凋亡;且凋亡相关蛋白Caspase3和核转录因子NKκB的表达则随奥沙利铂浓度增加而减少。

　　细胞凋亡是由多基因调控的主动死亡过程，凋亡异常与肿瘤发生发展有关，抗肿瘤药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。本研究显示凋亡相关蛋白Caspase3表达升高，可能与激活了线粒体非依赖性死亡受体通路有关，即活化的Caspase8作用于Bcl2家族的促凋亡成员使其催化断裂，其C端部分活化并转位至线粒体膜，引起线粒体跨膜势能降低或破坏，释放出膜间腔的cyt C和procaspase9等死亡因子，在dATP和cyt C参与下，procaspase9自身催化形成活性Caspase9，激活下游proCaspase3，导致细胞凋亡。在细胞凋亡信号转导中Caspase3起核心作用，其被激活后可直接水解与细胞凋亡相关的蛋白，使细胞发生不可逆的凋亡[8]。

　　凋亡调控过程中，核转录因子NKκB也是一种非常重要的因子，它是B细胞核提取物中一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强κB序列特异结合的蛋白因子。NKκB与凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族参与了凋亡途径的调控。IAP主要通过抑制半胱氨酸蛋白水解酶Caspase3、7、9等关键酶的活性而发挥作用,可双重阻断凋亡，如XIAP、cIAP1C和IAP2等可直接结合Caspase9，抑制下游效应酶的活化，同时又可抑制活化的Caspase3和Caspase7，阻止Caspase3反馈激活Caspase9。IAP家族中与NFκB抗细胞凋亡作用密切相关的蛋白有cIAP1、c1AP2和XIAP。XIAP除具有抑制Caspase3、Caspase7作用外，还有阻止JNK激活的作用，能泛素化和降解TAK1激酶而抑制TGFβ1诱导的凋亡和JNK激活而发挥抗凋亡作用。Survivin作为IAP家族成员也加入了NFκB调节的抗凋亡行列。

　　绝大多数化疗药物通过线粒体途径激活细胞凋亡，因此IAP对凋亡的调控是影响化疗药物发挥细胞毒作用的关键。本研究苯丁酸钠联合奥沙利铂后肿瘤细胞凋亡率明显增高，但核转录因子NKκB水平则呈下降趋势，提示药物的抗肿瘤效应可能与NFκB发挥抑制作用有关。

　　【参考文献】

　　[1]Andre T,Boni C,MounedjiBoudiaf L,et al.Oxaliplatin,fluorouracil,and leucovorin as adjuvant treatment for colon cancer[J].N Eng J Med,2004,350(23):2 343-2 351.

　　[2]Stebbing J,Bower M,Syed N,et al.Epigenetics:an emerging technology in the diagnosis and treatment of cancer[J].Pharma Cogenomics,2006,7(5):747-757.

　　[3]Sansam CG,Roberts CW.Epigenetics and cancer:altered chromatin remodeling via Snf5 loss leads to aberrant cell cycle regulation[J].Cell Cycle,2006,5(6):621-624.

　　[4]盂 玫,姜军梅,尹晓燕,等.苯丁酸钠对两种人肝癌细胞抑癌基因表达的影响[J].中国药理学通报,2005,21(11):1 406-1 407.

　　[5]高 静,栾信庸,许风雷,等.苯丁酸钠单用与氟尿嘧啶或顺铂联用对喉癌Hep2细胞株的影响[J].中国新药与临床杂志，2005,24(10):778-780.

　　[6]狄 茜,李 扬,赵雪俭，等.丁酸钠对前列腺癌PC3M 细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用[J].吉林大学学报(医学版),2004,30(5):710-712.

　　[7]Fesik SW.Promoting apoptosis as a strategy for cancer drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2005,5(11):876-885.

　　[8]Ledgerwood EC,Morisom IM.Targeting the apoptosome for cancer theraphy[J].Clin Cancer Res,2009,15(2):420-424