5杂氮2′脱氧胞苷联合苯丁酸钠对人结肠癌细胞HT29的抑制作用

　　作者：宋仕茂， 朱圣明， 骆志国， 丁 珺， 莫正英 作者单位：(郧阳医学院附属太和医院肿瘤科,湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的：探讨DNA甲基化抑制剂5杂氮2′脱氧胞苷(5aza2dC)联合组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(SPB)的抗肿瘤效应及其机制。方法：将HT29细胞分为：对照组、SPB(1 mmol/L)处理组、5aza2dC (10 μmol/L)处理组、5aza2dC (10 μmol/L)+SPB(1 mmol/L)处理组。MTT法测定各处理组细胞的生存曲线，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期。结果：生长曲线结果提示：5aza2dC和SPB均能抑制HT29细胞的生长增殖，但差异不明显，联合应用后，细胞增殖得到明显抑制;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：SPB、5aza2dC、SPB+5aza2dC处理HT29后，细胞凋亡率分别为11.32%、20.25%和42.37%，三者比较有统计学差异(P<0.05);细胞周期分布检测显示：与对照组相比，单用SPB处理细胞，细胞周期分布变化不明显，5aza2dC处理细胞后， 59.02%的细胞周期阻滞在G1期，而SPB联合5aza2dC后，S期细胞比例明显减少，G1期细胞比例可达73.7%,4组比较差异有统计学意义 (P<0.05)。结论：5杂氮2′脱氧胞苷联合苯丁酸钠可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用。

　　【关键词】 DNA甲基化;HT29;苯丁酸钠;5杂氮2′脱氧胞苷

　　Inhibition of 5aza2′deoxycytidine Combined Sodium Phenylbutyrate on Human Colon Cancer Cell Lines HT29 SONG Shimao,ZHU Shengming,LUO Zhiguo,DING Jun,MO Zhengying (Department of Oncology， Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To investigate the antitumor effects of DNA methylation inhibitor(5aza2'deoxycytidine,5aza2dC) combined histone deacetylase inhibitor(sodium phenylbutyrate,SPB) on human colon cancer cells and its possible mechanism.Methods The HT29 cells were divided into control group, SPB(1 mmol/L)group, 5aza2dC (10 μmol/L) group and 5aza2dC (10 μmol/L)+ SPB(1 mmol/L) group.The survival curve was tested by MTT assay and the apoptotic ratio and cell cycles were measured by flow cytometry.Results The survival curve indicated that the proliferation of HT29 could be inhibited with single 5aza2dC or SPB,but very significant difference of inhibition with control group was observed in combined group;the apoptotic ratio of three groups were 11.32%, 20.25%,42.37% respectively,and they were significant difference(P<0.05);Compared with control group,the cell cycle of SPB group had no obvious change,59.02% cells of 5aza2dC group was blocked at phase G1,but in combined group the rate of cells at phase S was significantly decreased,the rate of cells at phase G1 was high to 73.7% (P<0.05). Conclusion 5aza2dC combined SPB could effectively antitumor through inhibiting HT29 proliferation,inducing apoptosis and blocking the cell cycles.

　　Key words:DNA methylation;HT29;Sodium phenylbutyrate;5aza2′deoxycytidine

　　随着癌基因和抑癌基因转录表达调控机制的阐明，肿瘤细胞表观遗传学改变在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视,针对肿瘤细胞表观遗传学改变所采取的干预措施也逐渐成为近年来抗肿瘤治疗研究的新策略。5杂氮2′脱氧胞苷(5aza2′deoxycytidine,5aza2dC)和苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate,SPB)是两种分别通过抑制甲基化转移酶和组蛋白脱乙酰化酶活性起到有效抗肿瘤作用的表观遗传修饰剂。大量的实验研究证实[1-2]，5杂氮2′脱氧胞苷可对肺癌、鼻咽癌等多种肿瘤细胞产生生长抑制、诱导凋亡等综合抗肿瘤效应，且这种抗肿瘤效应具有显著的量效关系。诸多的文献报道[3-5]，苯丁酸钠能通过下调组蛋白脱乙酰化酶活性起到对肝癌、宫颈癌、脑胶质瘤等肿瘤细胞的抑制作用。然而，单用这两种表观遗传修饰剂所起到的抗肿瘤效果有限，且5aza2dC对甲基化转移酶的抑制作用不具备组织特异性，大量使用该药物可引起正常基因甲基化调控紊乱，而SPB却具有低毒、可大量口服以实现体内药物浓度的独特优势。因此，表观遗传修饰剂的联合用药可能是增加疗效、减小毒副反应的较好途径[6]。

　　国内外有一些研究初步报道了这两种表观遗传修饰剂联合运用对骨髓瘤、白血病等的疗效[7-8]，但在结肠癌等实体肿瘤上是否具有同样的疗效尚不清楚。本研究通过5aza2dC联合SPB处理人结肠癌细胞系HT29，探讨该联合方案的协同抗肿瘤作用，以期为表观遗传修饰剂用于肿瘤治疗提供理论依据和实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株与材料

　　人结肠癌HT29细胞(武汉大学细胞典藏中心)。MTT(Amersco公司)。二甲亚砜(SIGMA公司)。凋亡检测试剂盒(南京凯基生物有限公司)。5aza2dC(美国Sigma公司，用含10%小牛血清的RPMI培养液溶解，配成浓度为10-3 mol/L的储存液，-20 ℃保存，使用时用1640培养液稀释为工作液)。苯丁酸钠(德国ALEXIS公司)，以RPMI 1640培养液配制成储存液，-20 ℃保存。BIORAD 550酶联免疫检测仪(美国伯乐公司)。流式细胞仪(美国Beckman公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养:将HT29细胞置于37 ℃、5%CO2孵箱中、用含有10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养。2～3 d换液，取对数生长期细胞分组进行实验。分为4个处理组：对照组、SPB(1 mmol/L)组、5aza2dC (10 μmol/L)组、5aza2dC (10 μmol/L)+SPB(1 mmol/L)组。

　　1.2.2 MTT法检测细胞生长曲线:取贴壁生长的对数期细胞，常规胰酶消化、吹匀，在96孔板中按104/孔接种细胞，每组12孔重复。24 h后，吸出每孔培养液，加入实验药物处理HT29细胞，继续培养24、48、72、96、120 h，实验终止前4 h加入MTT液20 μL/孔，实验结束后吸取培养液，每孔加入150 μL DMSO，平板震荡10 min，酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定各孔吸光度OD值，绘制细胞生长曲线。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡:在30 cm2培养瓶中以4×105个/瓶接种对数期HT29细胞，12 h后PBS清洗细胞3遍，更换含有药物的培养基继续培养120 h，用胰酶消化、吹匀细胞并分至EP管，用PBS洗涤细胞2次(2 000 r/m,离心5 min)，收集5×105细胞;加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞和5 μL Annexin VFITC混匀后，再加入5 μL PI，混匀，避光反应10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.2.4 细胞周期检测:各取106个经不同药物处理120 h后的细胞，冷PBS洗涤2次，加入70%的冰乙醇固定24 h。洗涤细胞，与含10 μg/mL RNA酶的Tris盐酸缓冲液共同孵育30 min。加50 μg/mL PI进行细胞DNA染色，流式细胞仪分析细胞DNA含量分布。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 13.0 软件进行统计学处理，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，以P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞增殖曲线

　　相对于未经任何药物处理的HT29细胞，SPB处理组和5aza2dC处理组细胞的增殖速度均明显减慢，两者抑制细胞增殖的效果无明显差异(P>0.05)，而SPB联合5aza2dC处理后，细胞增殖速度则明显得到抑制，与前三组相比，差异具有统计学意义(P<0.05),见图1。

　　图1 HT29细胞经药物处理后的生长曲线

　　2.2 细胞凋亡

　　对照组细胞的自然凋亡率为1.85%，SPB组为11.32%，5aza2dC组为20.25%，SPB与5aza2dC联合组细胞凋亡率增加至42.37%，四者相比差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。图2 细胞经药物处理后的凋亡率

　　2.3 细胞周期

　　与对照组相比，单用SPB处理细胞，细胞周期分布变化不明显(P>0.05);单用5aza2dC处理细胞后，可使59.02%的细胞周期阻滞在G1期(P<0.05);而5aza2dC联合SPB后，S期细胞比例明显减少，G1期细胞比例可达73.7%(P<0.05),见表1。

　　3 讨论

　　DNA甲基化和组蛋白乙酰化是肿瘤细胞基因表达调控中两种最重要的表观修饰方式，这两种方式相互平衡，密切相关，可通过上调某些癌基因的表达和/或沉默抑癌基因实现细胞的恶性转化。但与肿瘤遗传学改变不同的是，肿瘤细胞的表观遗传学改变通常是一个可逆的调控过程，因此，借助不同的表观遗传修饰剂可改变肿瘤基因甲基化和乙酰化状态，达到抗肿瘤的目的[9-10]。肿瘤细胞中广泛存在着癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化，这种异常甲基化过程导致癌基因的过表达和/或抑癌基因功能的抑制而参与肿瘤的发生发展[11]。鉴于DNA甲基化转移酶在甲基化调控中的关键作用，可通过抑制该转移酶的活性使多种因高甲基化而失活的抑癌基因重新恢复功能。

　　5aza2dC是一种嘧啶核苷类似物，能通过与甲基化转移酶的共价结合，对该酶活性起到有效抑制作用。陶美满等[12]将5aza2dC处理人肾癌细胞后发现，5AzaCdR 明显抑制肾癌细胞OSRC2的生长，癌细胞体积缩小，核固缩，染色质凝聚成块，细胞凋亡率增高。Li认为[13]抑癌基因FHIT表达的增加是5AzaCdR抑制肺癌细胞A549的重要原因。崔军等[14]检测了5aza2dC对T24膀胱癌细胞生长的抑制作用及对RUNX3 基因的转录调节作用，结果显示：5aza2dC抑制T24膀胱癌细胞的生长，细胞凋亡增加，抑癌基因RUNX3甲基化状态逆转。

　　本研究利用5aza2dC处理结肠癌细胞HT29，MTT法连续5 d检测其生长增殖速度，结果显示：相对于未经任何药物处理的HT29细胞，5aza2dC可明显抑制肿瘤细胞的增殖速度，且随着时间的延长此抑制效果更加明显，延迟性增殖抑制现象也提示，5aza2dC对细胞增殖的抑制作用可能是通过恢复抑癌基因的功能来实现的。此外，与刘学峰等[15]的研究结果相似的是，本研究还发现，HT29细胞经5aza2dC处理后，细胞凋亡率明显增加，从而推测细胞凋亡是5aza2dC抗肿瘤的重要机制。

　　通常来讲，细胞增殖的抑制往往是凋亡增加和细胞周期受阻的综合效应，为证实细胞周期阻滞在5aza2dC对HT29增殖抑制中的作用，本研究利用流式细胞术检测了HT29经5aza2dC处理后的周期分布，结果发现，59%的细胞周期被阻滞在G0/G1期，而未经处理的细胞仅48%分布在G0/G1期，这与刘特、孔维佳的研究结果一致[16-17]。但5aza2dC对肿瘤细胞周期分布的影响各家报道并不一致。尹慧君和林洁等[18-19]认为5aza2dC对肺癌细胞A549和3株结肠癌细胞增殖抑制和凋亡诱导依赖于细胞周期G2/M期的阻滞。晁红霞等[20]用5aza2dC处理细胞后没有发现明显的周期阻滞，而细胞的凋亡率有明显的变化。这说明不同组织的肿瘤细胞对5aza2dC反应的敏感程度具有差异性[21]。

　　虽然体外研究已初步证实了5aza2dC的抗肿瘤作用，但大量的文献报道认为5aza2dC的这种抗肿瘤作用具有明显的量效关系[22]，而5aza2dC对甲基化转移酶的抑制作用不具备组织特异性，大量使用该药物可引起正常基因甲基化调控紊乱。以5杂氮2′脱氧胞苷为主的表观遗传学修饰剂联合用药不仅可大大增强其抗肿瘤效应，而且可减小药物用量，减少不良反应的发生。作为一种组蛋白脱乙酰化酶抑制剂，苯丁酸钠具有低毒的独特优势，且其通过诱导细胞分化等途径发挥的抗肿瘤作用已在多种肿瘤细胞的体外研究中得到证实。本研究将5aza2dC与SPB联合用于结肠癌细胞HT29的抗肿瘤研究，结果发现：联合用药后，细胞增殖抑制更加明显;细胞凋亡率增加至42.37%，起到了明显的协同作用。值得提出的是，高静和魏辉等[23-24]发现，单用SPB即可分别使喉癌细胞系Hep2和白血病细胞系细胞周期阻滞在G1期。在本实验中，SPB处理HT29细胞后，细胞周期G1期仅稍增加，并未产生统计学意义，而SPB和5aza2dC联合处理细胞后，HT29细胞G1期比例从48%提高到73%。同样是细胞敏感性差异的原因，Hao的实验结果表明[25]，虽然SPB处理可使白血病细胞Kasumi21细胞周期阻滞于G0/G1期，但5aza2dC与SPB联合则使细胞阻滞于G2/M期。结果差异性原因需进一步探讨。表1 不同浓度的5aza2dC联合SPB作用HT29细胞后的细胞周期分布注：与对照组相比，*P<0.05

　　总之，本研究通过5杂氮2′脱氧胞苷联合苯丁酸钠处理人结肠癌细胞系HT29，发现5杂氮2′脱氧胞苷联合苯丁酸钠具有良好的协同抗肿瘤作用，但在其它肿瘤细胞上的作用效果如何以及联合用药时的具体给药方式、剂量都还需要做更深入的研究。

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