白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞凋亡的诱导作用

　　作者：李志玖 郑 芳 蒋 飞, 骆志国, 熊 奎 作者单位：1郧阳医学院附属太和医院肿瘤科,湖北 十堰 442000;2武汉大学中南医院检验科,湖北 武汉 430071

　　【摘要】 目的：探讨白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞生长抑制及诱导凋亡的作用机制。方法：以不同浓度白藜芦醇处理Hela细胞，MTT法测定细胞增殖抑制率;TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Bad、Caspase9的表达。结果：经白藜芦醇处理的Hela细胞，增殖作用呈明显时效和量效关系，细胞凋亡率明显增高并呈浓度依赖性;Bcl2、Bax、Bad表达下降，Caspase9表达增加。结论：白藜芦醇对Hela细胞具有增殖抑制和诱导凋亡作用，其机制与下调Bcl2、Bax、Bad蛋白、上调Caspase9蛋白表达有关。

　　【关键词】 白藜芦醇;Caspase9;Bcl2;凋亡;Hela细胞

　　Resveratrol Induced Apoptosis of Hela Cell Line and Its Possible Molecular Mechanism LI Zhijiu1,2，ZHENG Fang2*，JIANG Fei1,LUO Zhiguo1,XIONG kui1 (1Department of Oncology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Department of Clinical Laboratory,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Hubei,430071,China)

　　Abstract: Objective To investigate the possible molecular mechanism in resveratrolinduced apoptosis of cervical tumor Hela cell line.Methods Hela cells were treated with various concentrations of resveratrol,the inhibitory rate of cell proliferation was measured by MTT,cell apoptosis was determined by TUNEL assay,and the expression of Bcl2,Bax,Bad and Caspase9 protein were detected by Western blotting.Results Resveratrol significantly inhibited the proliferation of Hela cell line in a timeand dosedependent manner.The rate of apoptosis was significantly increased and in a dosedependent manner.The expression of Bcl2,Bax,Bad was decreasd,but the Caspase9 expression was increased.Conclusion Resveratrol could inhibit the proliferation and induce apoptosis of human Hela cells.The effects may related to the downregulation of Bcl2,Bax,Bad protein expression and upregulation of Caspase9 protein expression .

　　Key words: Resveratrol;Caspase9;Bcl2;Apoptosis;Hela cell

　　相关研究表明，在肿瘤发生、发展及灭亡过程中，细胞凋亡起着重要的作用，而细胞凋亡信号转导过程的激活、存活和死亡调控基因之间的启动和平衡，决定细胞的存亡，因此细胞凋亡及细胞凋亡的信号转导途径作为肿瘤治疗的新靶点得到了越来越多的关注[1]。近年来研究者对植物提取物的抗肿瘤作用进行了大量的研究，相关报道显示白藜芦醇(Resveratrol)对白血病、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胃腺癌、胰腺癌、结肠癌和直肠癌等均具有明显的细胞凋亡诱导作用[2-3]。本实验研究观察白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，探讨白藜芦醇在宫颈癌防治中可能存在的作用及机理分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　MTT、白藜芦醇、培养基RPMI 1640购于Sigma公司，鼠抗人Bcl2、Bax、Bad、Caspase9单克隆抗体购于Santa Cruz公司，TUNEL试剂盒(Roche公司)。

　　1.2 细胞培养

　　人宫颈癌Hela细胞株购于ATCC。在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，CO2孵育箱(37 ℃，5%CO2)中贴壁培养，每48 h换液传代一次，取生长良好、处于对数生长期的细胞进行实验。

　　1.3 MTT检测

　　以1×105个/孔Hela细胞接种于96孔培养板，分为空白组(调零组)、白藜芦醇实验组(不同浓度)和对照组(不加药物的细胞组)，分别培养24、48、72 h后加入MTT液，继续培养4～6 h，吸弃孔中的上清液，加入DMSO 150 μL，震荡混合仪震荡10 min，酶联免疫检测分析仪570 nm处测定每孔吸光度值(OD值)。

　　抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。重复3次，取平均值。

　　1.4 TUNEL分析

　　Hela细胞置于细胞爬片上培养，分为白藜芦醇组(30、60、90 μmol/L)和对照组(不加药物的细胞组)，培养24 h后，弃上清，室温下加入PBS洗2次;加入预冷的0.2% TritonX 100，-20 ℃冰箱中放置5 min;取出用PBS洗涤2次×5 min后，加100 μL平衡缓冲液，加盖玻片，常温置10 min;加入亲和素标记的异硫氨酸荧光素(FITC,Sigma)，37 ℃避光保存60 min;2×SSC常温放置15 min;PBS洗涤3次，每次5 min。发生凋亡的细胞DNA出现断裂，可被dUTP标记，在荧光显微镜下呈阳性，计算细胞凋亡率。

　　1.5 Western Blotting

　　以5×105个Hela细胞接种于60 mm培养皿中，分为白藜芦醇实验组(30、60、90 μmol/L)和对照组(不加药物的细胞组)，培养24 h后，弃上清，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，调整各组蛋白浓度为一致。进行SDSPAGE凝胶电泳，在积层胶中用80 V恒压电泳直至溴酚蓝前沿到达积层胶与分离胶的边界处，改用120 V恒压电泳，至前沿到达凝胶底部时断电。半干法转膜后放入封闭液中(3%BSA)，4 ℃封闭过夜。弃去封闭液，PBS洗10 min×3，加一抗(稀释浓度为1∶1 000)，4 ℃过夜。PBS洗5 min，3～5次。将膜和TBST稀释的二抗(稀释浓度为1∶2 000)一起孵育，室温2 h。PBS洗5 min×3 。化学发光法检测，图像采集。

　　1.6 统计分析

　　采用SPSS 11.5统计软件对实验数据进行处理，对测定结果按多样本比较的KruskalWallis H检验进行统计学分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 白藜芦醇对Hela细胞的增殖抑制作用呈浓度、时间依赖性

　　结果显示，Hela细胞生长抑制率随白藜芦醇作用浓度的增加逐渐上升(图1)，KruskalWallis检验发现各组细胞抑制率之间有显著差异(P<0.01)。30、60、90 μmol/L白藜芦醇处理Hela细胞24、48、72 h后细胞生长抑制率逐渐上升(图2)，各组细胞抑制率之间有显著差异(P<0.01)。

　　2.3 白藜芦醇诱导Hela细胞凋亡呈浓度依赖性

　　TUNEL染色结果显示，30、60、90 μmol/L白藜芦醇处理Hela细胞24 h后,阳染细胞数量随白藜芦醇作用浓度增加而明显增多(图3)，通过定量分析得到相应的细胞凋亡率,随白藜芦醇作用浓度的增加而逐渐上升(图4)，各组间细胞凋亡率之间有显著差异(P<0.01)。

　　2.4 Western blotting

　　结果显示，30、60、90 μmol/L白藜芦醇处理Hela细胞24 h后Bcl2的表达随白藜芦醇的作用浓度增加而明显下降，而Bax、Bad、Caspase9的表达随白藜芦醇的作用浓度增加而明显上升(图5)，各组细胞的Bcl2、Bax、Bad、Caspase9与βactin的灰度比值之间有显著差异(P<0.01)。表明白藜芦醇诱导宫颈癌Hela细胞凋亡是通过调节凋亡相关蛋白的表达而实现的。

　　3 讨论

　　白藜芦醇属非黄酮类多酚化合物，是植物遇到真菌、紫外线照射等不利条件时所产生的植物补体，对植物本身起到保护作用，同时对人体也具有调节脂代谢、抑制血小板聚集、保护心血管、抗炎和抗肿瘤等多种生物学活性及药理作用[4]，其中抗肿瘤作用得到了人们越来越多的关注。目前的研究表明白藜芦醇可以抗氧化，清除机体氧自由基，防止氧自由基导致的DNA损伤[5];抑制RNA还原酶、DNA多聚酶和鸟氨酸脱羧酶的活性而抑制DNA的合成，干预细胞增殖信号传导和阻滞细胞周期而抑制肿瘤细胞的增殖[6];并且影响凋亡相关基因及细胞凋亡信号途径诱导肿瘤细胞凋亡[7];有抑制血管内皮生长因子(VEGF)等抑制肿瘤新生血管的形成和抑制基质金属蛋白酶9(MMP9)而抑制肿瘤转移[8]等功能。

　　相关研究表明白藜芦醇可以影响抑癌基因p53的表达，影响凋亡信号传导途径而诱导肿瘤细胞凋亡[9]。白藜芦醇可以通过线粒体途径和死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡。其抑制Bcl2家族中BclxL的表达和上调促凋亡的Bax蛋白的表达而导致细胞凋亡，这种变化导致线粒体膜通透性的改变，引起细胞色素C的释放，通过Caspase9的活化激活下游caspase[10]。但也有研究发现在Bax RNA干扰的细胞中同样存在线粒体途径介导的细胞凋亡[11]。而在其他一些研究中发现白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡是Fas/Fas L系统依赖性的，但也有研究者发现白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡作用不依赖于Fas/Fas L系统[10]。

　　本实验发现白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞的增殖活性有较明显的抑制作用，其诱导体外培养的Hela细胞发生凋亡呈明显的浓度-时间依赖关系。蛋白免疫印迹法检测结果表明白藜芦醇能影响Bcl2家族的表达，呈浓度依赖性的抑制Bcl2的表达和上调Bax、Bad以及Caspase9的表达，提示白藜芦醇是通过调节Bcl2家族蛋白的表达间接激活Caspase9，从而启动caspase级联效应而诱导Hela细胞凋亡。有研究表明在宫颈癌的发生过程中Fas基因表达下调[12]，存在Fas选择性，即Fas表达阳性的肿瘤细胞在增殖过程中淘汰，而Fas阴性的肿瘤细胞凋亡减少，从而逃避免疫细胞攻击致异常增殖。

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