调控ｍｉｃｒｏＲＮＡ-９９ｂ表达对宫颈癌ＳｉＨａ细胞增殖和凋亡的作用

　　作者：吴维光， 孙小丽， 陈 勍， 林仲秋 作者单位：中山大学附属第二医院妇科肿瘤专科， 广东 广州

　　【摘要】 【目的】 探讨上调microRNA-99b(miR-99b)表达对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用及可能的机制。【方法】 宫颈癌SiHa细胞分正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组。利用siPORT NeoFX Transfection Agent，阴性对照组细胞转染Cy3 dye labeled PremiR Negative Control，miR-99b调控组细胞转染Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor。实时定量PCR方法检测miR-99b表达，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测靶基因细胞分裂周期25A(CDC25A)蛋白表达。 【结果】 实时定量PCR结果显示，miR-99b调控组细胞，miR-99b表达增加107.23倍。正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组细胞增殖率分别为(3.26 ± 0.44)%、(3.65 ± 0.47)% 和(2.24 ± 0.45)%，细胞凋亡率分别为(8.12 ± 1.54)%、(8.75 ± 1.67)%和(14.26 ± 1.70)%，细胞CDC25A蛋白表达分别为0.50 ± 0.06、0.59 ± 0.05和0.31 ± 0.05。与正常对照组和阴性对照组比较，miR-99b调控组细胞增殖率、凋亡率和CDC25A蛋白表达差异均有统计学意义(P < 0.05)。 【结论】 上调miR-99b表达可通过降低靶基因CDC25A表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，miR-99b可能成为宫颈癌治疗的靶基因。

　　【关键词】 SiHa细胞; microRNA-99b; 增殖; 调亡

　　Effects of MicroRNA-99b Modulation on Proliferation and Apoptosis in SiHa Cells

　　WU Wei-guang， SUN Xiao-li， CHEN Qing， LIN Zhong-qiu

　　( Department of Gynecologic Oncology， The Second Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China )

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the effects of microRNA-99b (miR-99b) up-regulation on proliferation and apoptosis in SiHa cells and its possible mechanism. 【Methods】 The SiHa cells were divided into normal control， negative control， and miR-99b modulated groups. Cy3 dye labeled PremiR Negative Control was transfected into negative control cells， and Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor was transfected into miR-99b modulated cells with siPORT NeoFX transfection agent. The miR-99b expression was detected by real-time PCR. The cellular growth activity was assayed by MTT assay， and the apoptosis was tested by flow cytometry. The protein expression of CDC25A was measured by Western blot analysis. 【Results】 The miR-99b expression in miR-99b modulated cells increased 107.23 fold. The cellular growth ratio of normal control group was 3.26% ± 0.44%， of negative control group 3.65% ± 0.47%， of miR-99b modulated group 2.24% ± 0.45%. The apoptosis ratio of normal control group was 8.12% ± 1.54%， of negative control group 8.75% ± 1.67%， of miR-99b modulated group 14.26% ± 1.70%. The CDC25A protein expression of normal control group was 0.50 ± 0.06， of negative control group 0.59 ± 0.05， of miR-99b modulated group 0.31 ± 0.05. The cellular growth ratio， apoptosis ratio， and CDC25A protein expression had significant difference between miR-99b modulated group and two control groups (P < 0.05). 【Conclusions】 The miR-99b up-regulation could suppress the cellular proliferation and induce apoptosis in SiHa cells by decreased target genes CDC25A expression. The miR-99b may be a target gene for cervical carcinoma treatment.

　　Key words： SiHa cells; microRNA-99b; proliferation; apoptosis

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2008，29(6)：670-675]

　　MicroRNAs(miRNAs)是一组内源性的、大小在19 ～ 25个核苷酸的单链RNA分子，广泛存在于植物、动物以及病毒等真核细胞生物中，是不编码蛋白质的短小RNA。miRNA与靶mRNA的3′UTR碱基配对，通过抑制mRNA的翻译或直接使其降解，使基因在转录后水平产生沉默，调控基因表达[1]。miRNA参与了动植物许多复杂的生命过程，包括发育、器官形成、凋亡、细胞增殖等。研究表明，miRNAs表达异常与恶性肿瘤发生密切相关[2-6]。宫颈癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，有宫颈癌鳞癌和腺癌两种主要病理类型。高危型人乳头瘤病毒(human papilomavirus， HPV)在宫颈上皮细胞恶性转化中发挥重要作用[7，8]，HPV16与宫颈鳞癌有关，HPV18与宫颈鳞癌有关，但宫颈癌发生的具体分子机制尚不清楚。作者曾利用miRNA芯片，筛选了HPV阳性宫颈鳞癌及癌旁组织差异表达miRNAs，发现microRNA-99b(miR-99b)在HPV阳性宫颈鳞癌组织中低表达，并应用定量PCR方法验证了芯片检测结果，目前miR-99b在宫颈癌恶性转化中的作用方面的研究未见报道。本研究体外上调人宫颈鳞癌SiHa细胞(HPV16阳性)miR-99b表达，观察细胞增殖和调亡的变化，以及miR-99b的靶基因细胞分裂周期25A(Cell division cycle 25A，CDC25A)蛋白表达变化，探讨miR-99b对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的调控作用及可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　人宫颈鳞癌细胞株SiHa细胞(本科实验室保存)，Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor、Cy3 dye labeled PremiR Negative Control和siPORT NeoFX Transfection Agent(Ambion)，miRNA Isolation Kit(Ambion)，SuperScript III Reverse Trandcriptase Kit(Invitrogen)，FITC-annexin V凋亡试剂盒和PI(Invitrogen)，MTT试剂盒(Sigma)，CDC25A单克隆抗体(Santa Crus)，定量PCR引物(Invitrogen)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养和转染 SiHa细胞在含100 mg/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液中，37℃、体积分数5%CO2条件下培养。取对数生长期的细胞接种于96孔板，密度达80%时，用siPORT NeoFX Transfection Agent转染Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor，以Cy3 dye labeled PremiR Negative Control作为阴性对照。转染24 h后，PBS洗1遍，更换含100 mg/L FBS的RPMI1640培养液继续培养72 h。细胞分3组：正常对照组(未转染细胞);阴性对照组(转染Cy3 dye labeled PremiR Negative Control);miR-99b调控组(转染Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor)。

　　1.2.2 荧光实时定量PCR检测miR-99b Trizol一步法提取细胞总RNA，异丙醇法浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度，甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量。取60 ng总RNA，应用miRNA Isolation Kit分离小于100 nt的小分子RNA，具体操作按说明书进行。应用SuperScript III Reverse Trandcriptase Kit逆转录合成cDNA后，再应用PRISM 7000型定量PCR仪(Applied Biosystems)进行定量PCR检测。相应的PCR引物序列见表1，PCR条件：95℃15 s，60℃30 s，74℃ 3 s，共40个循环。采用U6 RNA作为内标，进行归一化。采用美国Biosystem公司的Sequence Detection system (SDS) 2.2.2软件进行数据分析。样品目的基因的相对表达率(Relative Expression， RQ)采用△△CT方法计算，RQ=2△△CT(CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数，△CTsample = CTsample - CTU6 sample，△CTcontrol = CTcontrol -CTU6 control，△△CT=△CTsample - △CTcontrol)。

　　1.2.3 MTT法检测细胞增殖率 取各组细胞，调整细胞浓度为5 × 105/mL，接种于96孔培养板中，每组细胞设3个平行孔。细胞贴壁后，加入无血清培养液培养12 h，使细胞同步化。更换含100 mg/L FBS的RPMI1640培养液，37 ℃、50 mL/L CO2条件下培养72 h。每孔加入浓度为5 g/L的四甲基偶氮唑蓝(MTT)液20 μL，继续培养4 h，弃培养液，加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪测定各孔490 nm处的吸光度(A值)。细胞增殖率 = (实验组平均A值)/(对照组平均A值) ×100%。实验重复3次。

　　1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 流式细胞术检测细胞凋亡操作按凋亡试剂盒说明书进行。收集各组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，在0.5 mL结合缓冲液重悬细胞，再加入6 μL的 FITC-annexin V和20 μL的PI，室温下避光孵育15 min，离心弃上清，加入300 μL 结合缓冲液，流式细胞仪(FACS Calibur)检测凋亡率，计数1×104个细胞，实验重复3次。

　　1.2.5 Western blot检测CDC-25A蛋白 收集各组细胞，裂解缓冲液提取细胞总蛋白，经Bradford法定量后进行SDS-PAGE电泳，蛋白量为20 μg，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，加CDC25A(1：400)单克隆抗体，4℃过夜，TBST洗3次，每次15 min。加入HRP标记的二抗，室温反应，TBST洗3次，每次15 min，ECL发光压片显色，以β-actin为内参照，LabWork 3.0 UVP软件分析条带的光密度值。目的蛋白量=目的蛋白条带光密度/β-actin条带光密度，实验重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示(x ± s)，采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，多组间差异采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD法。

　　2 结 果

　　2.1 荧光显微镜观察Cy3标记的阴性对照试剂细胞转染率

　　荧光显微镜下观察转染Cy3 dye labeled PremiR Negative Control的SiHa细胞见图1。结果示95%以上的SiHa细胞可见荧光，说明细胞转染率达95%。

　　2.2 定量PCR检测结果

　　为观察转染Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor对SiHa细胞miR-99b表达的作用，我们应用荧光定量PCR方法检测各组细胞miR-99b表达，并采用U6进行归一化。miRNAs定量PCR的扩增曲线和溶解曲线见图2。溶解曲线呈单峰，显示引物的特异性较好。荧光定量PCR结果显示，与阴性对照组相比，miR-99b调控组细胞miR-99b表达增高107.23倍。

　　2.3 MTT检测细胞增殖率结果

　　正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组细胞增殖率分别为(3.26 ± 0.44)%、(3.65 ± 0.47)%和(2.24 ± 0.45)%。正常对照组与阴性对照组细胞增殖率比较，差异无统计学意义(P值为0.333)，而miR-99b调控组细胞增殖率与两对照组比较明显降低，差异均有统计学意义(P值分别为0.033和0.009)。

　　2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率结果

　　流式细胞仪检测凋亡见图3。正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组细胞凋亡率分加为(8.12 ± 1.54)%、(8.75 ± 1.67)%和(14.26 ± 1.70)%。正常对照组与阴性对照组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P值为0.624)，而miR-99b调控组细胞凋亡率与两对照组比较明显增加，相差均有统计学意义(P值分别为0.002和0.003)。

　　2.5 免疫印迹检测CDC25A蛋白表达结果

　　CDC25A蛋白免疫印迹检测见图2。正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组细胞CDC25A蛋白表达分别为0.50 ± 0.06、0.59 ± 0.05和0.31 ± 0.05。正常对照组与阴性对照组细胞CDC25A蛋白表达比较，差异无统计学意义(P值为0.085)，miR-99b调控组细胞CDC25A蛋白表达与两对照组比较，表达降低，差异均有统计学意义(P值分别为0.005和0.001)。

　　3 讨 论

　　近年来，miRNA作为生物体重要的基因调控分子，与疾病的关系尤其是与肿瘤的关系成为生物医学领域研究的热点。对基因组中肿瘤相关基因区域的序列分析时发现，有52.5%的miRNA编码基因位于其附近[9]，提示miRNA对肿瘤相关基因的调控作用。随着miRNA芯片技术的发展和广泛应用，已确定多种恶性肿瘤中存在miRNAs表达异常。miRNAs在肿瘤中表达异常最早在B细胞慢性白血病(CLL)中被证实，患者中50% ～ 60%出现miR-15a和/或miR-16-1表达缺失或下调[3]，而miR-15a和miR-16-1也位于CLL相关染色体区域13q14，因此它们可能有肿瘤抑制基因的功能。此后研究又发现了miR-143和miRv145在结肠癌中表达下调[4]，在乳腺癌中miR-10b、miR-125b和miR-145表达下调，miR-21和miR-155表达上调[5]， Let-7在肺癌细胞中表达下调，上调Let-7可抑制肺癌细胞增殖[6]，推断miRNA可能是一类新的癌基因或抑癌基因，miRNA也可能成为肿瘤治疗的新靶点[10]。

　　迄今为止，miRNA在宫颈癌发生发展中作用的研究尚未见报道，Martinez等[11]研究显示，HPV16可抑制宫颈癌细胞miR-218的表达，说明HPV感染与miRNAs表达异常关系密切。在前期的研究中，我们应用miRNA芯片筛查了10例HPV阳性宫颈鳞癌组织与癌旁组织差异表达miRNAs，发现在HPV阳性宫颈鳞癌组织中，46个miRNA表达差异，上调表达的20个，下调表达的26个。其中miR-99b在HPV阳性宫颈鳞癌中表达下调表达，差异倍数为3.24倍，定量PCR也验证了芯片检测结果。说明在HPV阳性宫颈鳞癌组织中，存在miR-99b表达下调，但其具体的生物学功能还不清楚。

　　关于miRNAs的生物功能，目前只有少部分miRNAs的生物学功能得到确定，大部分miRNAs的生物学功能尚未阐明。miRNAs生物学功能研究最重要的步骤是寻找到它们调控的靶基因，生物信息学的方法，使miRNAs功能的研究更加方便和快捷，开辟一条新的miRNA基因功能研究路线。研究人员设计了多种计算机软件，对miRNAs靶基因的预测有较高的准确性。我们应用MIRANDA软件[12] (http：//www.microrna.org/)，对miR-99b的靶基因进行预测，发现miR-99b的靶基因有303个，作用范围相当广泛，涉及到癌基因、细胞周期调控、细胞增殖与分化、细胞凋亡调控、转录调控、信号转导通路等。在其靶基因中，CDC25A为原癌基因，同细胞转化、肿瘤形成、关卡调控以及凋亡密切相关[13]。CDC25A在多种肿瘤细胞中高表达，HPV感染可引起宫颈癌细胞CDC25A表达增加[14]，下调CDC25A表达可抑制食管癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[15]。

　　本研究中，应用Ambion公司提供的细胞microRNA功能研究的系列试剂，上调宫颈癌SiHa细胞miR-99b表达，细胞增殖能力明显下降，细胞调亡率增加。结果说明miR-99b对宫颈癌细胞的增殖和凋亡有调控作用，上调miR-99b表达，可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。还应用Western blot检测了miR-99b靶基因CDC25A蛋白表达，发现上调miR-99b表达后，细胞CDC25A表达降低。说明miR-99b可通过调控靶基因CDC25A的表达，对宫颈癌细胞的增殖和凋亡发挥调控作用。综上所述，miR-99b在宫颈癌的发生和发展过程中发挥重要作用，上调miR-99b表达可抑制宫颈癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，miR-99b有可能成为宫颈癌治疗的靶基因。

　　【参考文献】

　　Wu L， Fan J， Belasco JG. MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(11)：4034-4039.

　　李晓霞，李瑞平，杜紫明，等. 鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究[J]. 中山大学学报：医学科学版，2007，28(6)：607-612.

　　Calin GA， Dumitru CD， Shimizu M， et al. Frequent deletions and down regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2002，99(24)：15524-15529.

　　Michael MZ， O'Connor SM， van Holst Pellekaan NG， et al. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia[J]. Mol Cancer Res， 2003，1(12)：882-891.

　　Iorio MV， Ferracin M， Liu CG， et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J]. Cancer Res， 2005，65(16)：7065-7070.

　　Esquela-Kerscher A， Trang P， Wiggins JF， et al. The let-7 microRNA reduces tumor growth in mouse models of lung cancer[J]. Cell Cycle， 2008，7(6)：759-764.

　　郭晓强，刘海燕. 微小核糖核酸与肿瘤发生[J]. 新医学，2006，37(4)：270-271.

　　Schiffman M， Castle PE， Jeronimo J， et al. Human papillomavirus and cervical cancer[J]. Lancet， 2007，370(9590)：890-907.

　　Calin GA， Sevignani C， Dumitru CD， et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004，101(9)：2999-3004.

　　Sassen S， Miska EA， Caldas C. MicroRNA： implications for cancer[J]. Virchows Arch， 2008，452(1)：1-10.

　　Martinez I， Gardiner AS， Board KF， et al. Human paoillomavirus type 16 reduces the expression of microRNA-218 in cervical carcinoma cells[J]. Oncogene， 2008，27(18)：2575-2582.

　　Betel D， Wilson M， Gabow A， et al. The microRNA. org resource： targets and expression[J]. Nucleic Acids Res， 2008，36：D149-153.

　　Barré B， Vigneron A， Coqueret O. The STAT3 transcription factor is a target for the Myc and riboblastoma proteins on the CDC25A promoter[J]. J Biol Chem， 2005，280(16)：15673-15681.

　　戴淑真，田 甜，孔守芳，等. 外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞CDC25A表达的影响[J]. 现代妇产科进展杂志，2006，15(11)：844-849.