ＵＧＴ２Ｂ１７基因的缺失多态性与鼻咽癌危险性的关系

　　作者：徐金芬， 李大疆， 潘清华， 张如华， 陈丽珍， 冯启胜， 曾益新， 贾卫华 作者单位：( 华南肿瘤学国家重点实验室∥中山大学肿瘤防治中心实验研究部， 广东 广州 510060 )

　　【摘要】 【目的】 探讨UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌发病的相关关系。【方法】 利用基因特异性引物扩增的方法鉴定不同人群UGT2B17基因的缺失多态性，研究对象包括鼻咽癌高发区广东地区的170例鼻咽癌患者(96例血标本和74例组织标本)和96例健康对照(血标本)，鼻咽癌低发区河南及山西的各96例健康对照(血标本)，观察UGT2B17基因的缺失多态性在中国鼻咽癌高发区和低发区人群之间的差异，并通过在鼻咽癌高发区广东进行的病例对照研究，运用二分类logistic回归分析研究UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌危险性的相关关系。【结果】 ① UGT2B17基因的纯合缺失型(del/del)在中国不同地区人群中的分布频率均较高(广东健康人群，67.5%;广东鼻咽癌患者，62.9%;河南健康人群，58.2%;山西健康人群，66.3%)，且相互之间没有显著性差异(P > 0.05)，但其远远高于非洲和高加索人群(约10%)。② UGT2B17的各基因型和鼻咽癌之间的危险性分析结果显示UGT2B17基因的各基因型均不会增加鼻咽癌发病的危险性(del/ins：OR=1.693，95%CI=0.636～4.503;del/del：OR=1.132，95%CI=0.490～2.616; del/del+del/ins：OR=1.253，95%CI=0.551～2.847)。【结论】 ① UGT2B17基因的缺失多态性可能与种族密切相关， ② UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌的发病未见显著关联。

　　【关键词】 鼻咽癌; UGT2B17基因/遗传学; 缺失多态性

　　Correlation of Deletion Polymorphism of UGT2B17 Gene　with Risk of Nasopharyngeal Carcinoma

　　XU Jin-fen， LI Da-jiang， PAN Qing-hua， ZHANG Ru-hua， CHEN Li-zhen，FENG Qi-sheng， ZENG Yi-xin， JIA Wei-hua

　　(State Key Laboratory of South-East Oncology∥Department of Research， Cancer Center， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510060， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the relationship of deletion polymorphism of UGT2B17 with risk of nasopharyngeal carcinoma (NPC). 【Methods】 Using gene-specific primers amplification method to explore the deletion polymorphism of UGT2B17 among different groups， including 170 Guangdong NPC patients (96 blood samples and 74 biopsy samples)， 96 healthy Cantonese and 96 healthy volunteers from Henan as well as 96 from Shanxi respectively (blood samples). The frequency of UGT2B17 deletion polymorphism in genomic DNA was compared among each groups. Meanwhile， conditional logistic regression was used to analyze the relationship between the deletion polymorphism of UGT2B17 and NPC. 【Results】 ①The frequency of UGT2B17 homozygous deletion genotype(del/del) is high (Guangdong healthy，67.5%;Guangdong NPC，62.9%;Henan healthy，58.2%;Shanxi healthy，66.3%)and has no significant difference among people from different areas in China， but it is higher than people in Africa or Caucasus(about 10%).② The risk estimation shows that none of the UGT2B17 genotype can increase the risk of NPC (del/ins：OR=1.693， 95%CI= 0.636-4.503; del/del：OR=1.132， 95%CI=0.490-2.616; del/del+del/ins：OR=1.253; 95%CI=0.551-2.847). 【Conclusion】 ①There may be a close relationship between race and the deletion polymorphism of UGT2B17.②There is no significant association between

　　目前认为遗传因素、EB病毒感染和某些环境因素与鼻咽癌的发生有关[1]。遗传因素包括HLA Ⅰ型和Ⅱ型等位基因多态性，谷胱苷肽-S-转移酶M1、细胞色素P450 2E1基因等的核苷酸多态性等[2-4]。本课题组Feng等通过遗传学连锁分析发现在染色体4p15.1-q12区有一个NPC易感位点，表明该区存在NPC遗传易感的候选基因[5]。进一步的研究发现，该区内的新基因LOC344967的启动子区的突变，导致该基因转录调节区产生一新的AP-1结合位点，从而使该基因在鼻咽癌细胞中表达显著上调，该基因可能是鼻咽癌易感基因之一[6]。2004年Xiong等[7]将湖南家族性鼻咽癌易感基因定位于3p21.31-21.2区域。提示鼻咽癌的易感机制可能并不是由一个主效基因决定的，而是受多个高频率、低外显的易感基因影响。UGT2B17基因属于UDP-葡萄糖苷转移酶(UGT)家族，它由6个外显子组成，约跨越30 kb，荧光原位杂交显示其定位于染色体4q13区域[8]。近年来，人们发现UGT2B17基因存在普遍的遗传缺失现象，这种遗传差异对疾病造成的影响已经引起了众多研究者的关注。目前研究表明UGT2B17基因的缺失多态性与前列腺癌，肺癌及其他一些与吸烟有关的恶性肿瘤相关[9-12]，但尚未见UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌易感性的相关研究。鉴于UGT2B17基因在染色体的定位与鼻咽癌易感基因定位区域邻近，有研究在鼻咽癌细胞系中也检测到了UGT2B17基因的纯合性缺失。本研究利用病例-对照研究设计，对UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌易感性的关系进行初步探讨，从而为鼻咽癌易感基因的筛查提供佐证。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　本研究选取对象包括2003年8月到2005年9月来自广州市中山大学肿瘤防治中心门诊和住院的鼻咽癌患者96例和同期来自中山大学附属第一医院的健康体检人群96例，2006年7月到2006年 12月来自河南省军区体检中心和山西大同第三人民医院体检中心的健康体检人群各96例。鼻咽新鲜活检组织和石蜡组织标本(共74例)来自2006年4月到2006年8月中山大学肿瘤防治中心住院的鼻咽癌患者。其中，鼻咽癌患者(包括血和组织标本)共170例，男女比例约为3∶1，平均年龄为47.30(S=11.4);广东，河南，山西地区的健康人群各96例，男女比例大约均为1∶1，平均年龄分别为46.41(S=14.2)，22.09(S=2.8)，43.41(S=9.3)。本研究经中山大学附属肿瘤防治中心伦理委员会批准。

　　1.2 DNA提取

　　外周血DNA 提取采用外周血DNA 抽提试剂盒 (美国QIANGEN 公司)。鼻咽新鲜组织标本DNA 的提取方法如下：即先将鼻咽组织标本在裂解液中55 ℃消化16 h。该裂解液包括：10 mmol/L Tris·HCl (pH 8.0)， 100 mmol/L NaCl， 25 mmol/L EDTA， 0.5%肌氨酰和蛋白酶K (0.1 mg/mL)，再用等体积酚氯仿抽提两次，加两倍体积无水乙醇沉淀DNA，在沉淀液中加入RNA 酶A(0.1 mg/mL)，37 ℃孵育5 ～ 8 min，然后用蒸馏水溶解DNA。石蜡组织DNA提取参照Goelz SE 等1985年所报道的方法[14]。每一例石蜡标本用二甲苯和无水乙醇抽提两次。DNA提取后经紫外分光光度仪定量并稀释至30 ng/μL，用于PCR扩增。

　　1.3 基因型鉴定

　　利用基因特异性引物扩增的方法对UGT2B17的基因型进行鉴定。使用引物参照Willie WilsonIII等设计的用于扩增UGT2B17第六外显子的特异性引物序列Maker E和反映UGT2B17基因缺失的特异性引物序列Market J[14](图1)。引物序列如下：Marker E正向5?蒺-GAATTCATCATGATCAACCG-3?蒺反向5?蒺-ACAGGCAACATTTTGTGATC-3?蒺;Marker J 正向5?蒺-TGCACAGAGTTAAGAAATGGAGAGATGT G-3?蒺反向 5?蒺-GATCATCCTATATCCTGACAGAATTC TTTTG-3’采用通用PCR试剂盒(上海申能博彩)，PCR反应体系：总体积20 ?滋L，包括双蒸水 15.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，10 μmol/L dNTP 0.4 μL，20 μmol/L primer 正反向各0.5 μL，5 U/μL Taq plus DNA polymerase 0.5 μL，样品DNA 1 ?滋L。反应条件：Marker E：预变性95 ℃ 5 min;32循环：95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s;72 ℃延伸 30 s;72 ℃ 5 min; Marker J： 预变性95℃ 5 min;36循环：95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min;72℃ 5 min 。PCR产物分别于20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，Marker E对应的电泳条带为200 bp，Marker J对应的电泳条带为884 bp。UGT2B17基因型的判定根据PCR扩增结果决定。Marker E扩增成功表明基因插入，marker J扩增成功表明基因缺失，每份DNA样本都同时用这两对特异性引物扩增，若只有marker E被扩增成功，代表UGT2B17基因纯合性插入(ins/ins);若只有marker J被扩增成功，代表UGT2B17基因纯合性缺失(del/del);若两者皆可以扩增成功则代表基因既有缺失也有插入(del/ins)。

　　1.4 统计学分析

　　利用SPSS 13.0进行统计分析。运用的统计学方法有Pearson χ2检验和二分类Logistic回归分析。检验水准取0.05。

　　2 结果

　　2.1 UGT2B17各基因型在不同人群中分布的比较

　　UGT2B17各基因型在不同人群中的比较结果(表1)显示UGT2B17三种基因型的分布频率在鼻咽癌高发区广东的病人和健康人群之间没有显著性差异(P=0.336;因三种基因型的分布频率在鼻咽癌患者的血和组织中无差别，我们将血和组织标本合并进行分析)，同样在鼻咽癌高发区广东和鼻咽癌低发区河南的健康人群之间也无显著性差异(P=0.446)，但在鼻咽癌高发区广东和鼻咽癌低发区山西的健康人群却有显著性差异(P=0.011)。进一步分析发现UGT2B17基因的纯合缺失型(del/del)和杂合缺失型(del/ins)在两地区人群的分布频率无显著性差异，其纯合插入型在山西地区健康人群的分布频率低且有显著性差异(P=0.008)。另外，我们发现UGT2B17基因的纯合缺失型(del/del)在中国不同地区人群中的分布频率(广东鼻咽癌患者 62.9%，广东健康对照 67.5%，河南健康对照 58.2%，山西健康对照 66.3%)均较高且相互之间无显著性差异(P > 0.05)，但其远远高于非洲和高加索人群(约10%)。

　　2.2 UGT2B17的各基因型均不会增加鼻咽癌发病的危险性

　　对广东地区鼻咽癌患者和健康对照的性别，年龄因素进行校正后使用二分类Logistic回归分析鼻咽癌和UGT2B17各基因型之间的危险性关系(表2)，结果显示UGT2B17基因的杂合缺失型和纯合缺失型相对其纯合插入型(ins/ins)均不会增加鼻咽癌发病的危险性(del/ins：OR=1.693，95%CI=0.636～4.503;del/del：OR=1.132，95%CI= 0.490～2.616)，将UGT2B17基因的纯合缺失型和杂合缺失型合并后再与其纯合插入型进行比较结果显示仍不能增加鼻咽癌发病的危险性(OR=1.253，95%CI=0.551～2.847)，UGT2B17基因的纯合插入型和杂合缺失型合并后与其纯合缺失型进行比较也未降低鼻咽癌发病的危险性(OR=0.814;95%CI=0.454～1.461)。

　　3 讨论

　　3.1 UGT2B17基因的缺失多态性可能与种族相关

　　UDP-葡萄糖苷转移酶(UGT)家族是对一些内外源性化学物质进行糖脂化的酶家族，通过其糖脂化作用，可以增加这些化学物质的亲水性，便于其分泌和排泄。根据序列相似性和进化上的差异，UGT家族被分为两大家族(UGT1和UGT2)及四个亚家族(UGT1A，UGT1B，UGT2A，UGT2B)，UGT2B17即为UGT2B亚家族的一员。目前研究发现UGT2B17基因在人类基因组存在的普遍的遗传缺失现象。Spielman等[15]在利用不同人群EB病毒转化的淋巴母细胞系(来自HapMap项目)分析人种间4197个功能基因的表达水平时发现亚洲人与白人之间有超过1000个基因表达有显著差别，其中UGT2B17基因在亚洲人群中缺失的较常见，白人的平均表达水平超过亚洲人22倍。Park[9]等的研究结果发现在高加索人群和美裔非洲人群中UGT2B17基因的纯合缺失型的分布频率仅为11% 和12%。这也进一步说明在白色人种UGT2B17基因的缺失频率很低。我们的研究结果显示UGT2B17基因的纯合缺失型(del/del)的分布频率在中国各地区人群中均较高(约63%)且无显著性差异，但其远远高于非洲和高加索人群(约10%)。这一研究结果与以上研究结果一致说明亚洲人群UGT2B17基因的缺失较白色人种更为常见，之所以存在这种现象可能与种族差异相关，众所周知，亚洲人群大部分为黄色人种，可能因为种族遗传差异黄色人种更容易丢失UGT2B17基因，因此UGT2B17基因的缺失多态性可能与种族相关。

　　3.2 UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌的发病无明显相关关系

　　UGT2B17基因的表达产物主要通过其糖脂化作用代谢类固醇激素类物质和外源性毒性物质。Park和Karvpidis等[10，11]的研究结果均显示UGT2B17基因的缺失多态性与前列腺癌的发生相关，因为UGT2B17基因纯合缺失会丧失其表达，使雄激素不能被有效代谢故而不断累积促进前列腺癌的形成。Gallagher等[11]的研究发现UGT2B17的纯合缺失型(del/del)可降低亚硝胺4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNAL)葡萄糖脂化比率与女性肺腺癌的发生相关。在Lazarus的研究中[12]还提到UGT2B17基因的缺失会增加个体对与吸烟相关的肿瘤的易感性。以上研究说明UGT2B17基因的遗传缺失与多种肿瘤的发生都存在相关关系。

　　对于UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌的关系尚未见报道，为了深入探讨UGT2B17基因的缺失多态性在中国南北方人群分布的差异及其是否与鼻咽癌发生相关，我们选取中国不同地区的人群(包括鼻咽癌高发区广东和低发区河南，山西)作为研究对象对UGT2B17基因的缺失多态性进行了比较，我们的研究结果显示UGT2B17各基因型的分布频率在广东地区的鼻咽癌患者和健康对照以及在广东和河南地区的健康人群之间无显著性差异，但在广东地区和山西地区的健康人群之间有显著性差异，进一步分析发现其纯合插入型在山西地区分布频率较广东低且有显著性差异。这一统计结果还需扩大样本量后进一步验证。二分类 Logistic回归分析的结果显示UGT2B17基因的各基因型均不会增加鼻咽癌发病的危险性。这说明尽管UGT2B17基因的染色体定位与鼻咽癌的易感基因定位区域邻近，但它可能不是鼻咽癌的易感基因之一，或者不是在鼻咽癌发病过程中独立起作用的基因。

　　综上所述，我们的研究结果显示UGT2B17基因的缺失多态性可能与种族相关，但与鼻咽癌的发生未发现显著关联，该缺失突变在中国人群中的高频分布是否与中国人群特异的癌症谱有关，是一个非常值得探讨的问题。

　　致谢：感谢香港Lo Kwok Wai教授等提供的引物(Marker E和Marker J)和给予本实验室的支持。

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