NFκB和Stat3信号途径在胃癌组织和细胞系中的活化

　　作者：韩竞春，黄磊，张开立，陈晓燕，孔庆友，孙媛，吴茉莉，李宏 作者单位：大连大学附属新华医院 肿瘤科;大连海事大学环境生物研究所;大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室、基础医学院生物学教研室，辽宁 大连 116021

　　【摘要】目的 研究NFκB和Stat3信号通路在胃癌组织中的活化状态及其与胃癌发生、发展的关系。方法 应用免疫组化、RTPCR和Western蛋白印迹等方法，在胃癌组织和细胞系中检测NFκB和Stat3的活化状态。结果 NFκB和Stat3在胃癌组织中的表达明显高于癌前病变组织(P<0.01);并在胃癌细胞系中处于活化状态。结论 NFκB和Stat3信号通路在胃癌组织中呈活化状态，与胃癌发生、发展密切相关。

　　【关键词】 胃肿瘤 NFκB Stat3 信号传导

　　Activation of NFκB and Stat3 Signaling in Gastric Cancer Tissues and Cell Lines

　　Han Jingchun, Huang Lei, Zhang Kaili, Chen Xiaoyan, Kong Qingyou, Sun Yuan, Wu Moli, Li Hong

　　(Department of Oncology, Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University; Institute of Environmental Systems Biology, Dalian Maritime University; Department of Cell Biology and Liaoning Laboratory of Cancer Genomics, Dalian Medical University,Dalian 116021, China)

　　Abstract： Objective To illustrate the activation status of NFκB, Stat3 signalings and their correlations with gastric carcinogenesis.Methods Immunohistochemistry, RTPCR and western blotting were adopted to detect NFκB and Stat3 signaling activations in the gastric cancer tissues and cell lines. Results Expressions of NFκB and Stat3 were significantly higher in the cancer tissues compared with premalignant tissues (P<0.01). Conclusion Conclusion NFκB and Stat3 signalings were activated in gastric cancer tissues and associated with gastric carcinogenesis.

　　Key words： gastric neoplasm; NFκB; Stat3; signaling

　　胃癌是世界范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其确切的发病机制还不十分清楚[1]，目前认为是多因素参与的多阶段、多步骤、涉及多种基因改变的共同作用结果。因此研究胃癌发生、发展的分子生物学机制对于预防乃至选择合理的治疗策略都有着重要的意义。本研究对胃癌组织中NFκB和Stat3信号通路的活化状态进行探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 (1)标本来源和细胞系来源：54例胃癌及癌旁组织均选自大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室建立的人胃癌组织库。胃癌细胞系AGS和HGC27购于美国ATCC(American Type Cell Culture)细胞库。MGC803(人胃低分化黏液癌)和BGC823(人胃低分化癌)从北京肿瘤研究所购进。(2)抗体：鼠单克隆NFκB抗体(MSC8008，Cell Science，Sydney, Australia)，兔多克隆Stat3抗体(Santa Cruz，CA， USA)。

　　1.2 方法 (1)石蜡组织微阵列的制作：石蜡组织微阵列采用自制的阵列制作仪制作。(2)免疫组化染色：免疫组化试剂盒：HistostainTMplus Kits SP9003(山羊SP Kit)、SP9000(通用SP Kit)购自北京中山生物技术有限公司;按照SP试剂盒说明进行免疫组化染色。结果的判定按文献[2]进行。(3)细胞培养：①MGC803和BGC823细胞培养液：DMEM培养基，10%胎牛血清。②AGS及HGC27细胞培养液：Ham’s F12培养液， 10%胎牛血清，根据美国ATCC推荐[3～4]。在细胞培养箱中培养细胞至80%汇合时收集细胞，提取RNA和蛋白用于实验分析。(4)RNA提取和RTPCR分析：常规Trizol法提取总RNA。反转录体系依照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit试剂盒提供说明书进行操作，PCR引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)见参考文献[5～7]。(5)胃癌细胞系总蛋白的提取及Western印迹分析：常规提取细胞总蛋白。Western印迹分析参照文献[8]方法进行。

　　1.3 统计学方法 使用SPSS12.0版本统计软件，选用KruskalWallis检验方法。

　　2 结果

　　2.1 NFκB和Stat3在不同病变胃组织中的表达 见表1，图1。

　　表1 NFκB和Stat3在不同病变胃组织中的表达(略)

　　与癌前病变组比较，①P<0.01

　　图1 NFκB和Stat3在不同病变胃组织中的免疫组织化学染色结果(略)

　　2.1.1 NFκB在慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生中的阳性表达率均较低，分别为20%(3/15)和25.0%(2/8)，两组间比较没有统计学差异(P>0.05)。NFκB在胃癌组织中表达率为74.2%(23/31)，明显高于癌前病变组织(P<0.01)。

　　2.1.2 Stat3在癌前病变组织中的表达率为30.4%(7/23)，而在胃癌组织中的表达率为96.8%(30/31)。可见，胃癌组织明显高于癌前病变组织(P<0.01)。

　　2.2 胃癌细胞系中NFκB和Stat3的活化 NFκB和Stat3在四个胃癌细胞系中表达的RTPCR和Western蛋白印迹结果见图2。

　　图2 胃癌细胞系中NFκB和Stat3的RTPCR和Western blotting结果(略)

　　3 讨论

　　细胞的代谢、分裂、分化、生长和死亡等生命活动都与信号传导途径有关，信号传导通路的研究进展已将细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤发生等生命过程有机的联系起来[9]。肿瘤的信号传导通路是一个非常复杂的网络系统，而信号传导或转录调控机制是基因最终表达的基础。我们研究中发现，在胃癌的进展过程中出现Wnt信号传导通路的活化[10]，并调控下游基因的表达，而这些基因同时也是NFκB和Stat3信号途径的靶基因。因此，研究NFκB和Stat3信号途径在胃癌组织中的活化状态，对认识胃癌发生发展中信号传导通路的网络结构十分必要。

　　NFκB(nuclear factorkappaB)是由Sen等于1986年首先在B细胞中发现的一种核蛋白[11]，它广泛存在于细胞中，是重要的转录调控因子，能与多种细胞基因的启动子和增强子序列位点发生特异性结合，从而调节基因的转录和表达，主要参与细胞分化、免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤的发生发展等多种生物学功能。Stat3(signal transducers and activator transcription factor 3)是近年来研究异常活跃的转录因子，多项研究结果显示Stat3在多种肿瘤组织与细胞系中异常表达和活化，并与肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、血管新生和免疫逃避等密切相关。本研究结果显示，NFκB和Stat3在胃癌组织中的表达率均较高，明显高于癌前病变组织，而且NF-κB和Stat3的活化与胃癌组织学类型无关，表明其在胃癌组织中的高活化状态可能与胃癌的发生发展密切相关，可能是导致胃癌组织中相关基因表达的重要因素。

　　大量研究表明众多的信号转导途径并非独立存在、独立完成某种生物学功能，它们在不同的层次上存在着信号交流，因而构成了复杂而精细的信号网络系统[12～13]。我们的研究也发现，在胃癌的发生发展中存在着至少包括Wnt、NFκB和Stat3三条信号通路在内的多种信号通路的活化。因此与单一的研究某个基因或某条信号通路在肿瘤形成和进展过程中的作用相比，采用系统生物学观点，在阐明单一信号通路的基础上，进一步分析多种信号通路之间的相互联系(Crosstalking)，从而有可能将各条通路相互整合，在更高层次建立细胞信号传导通路的网络[14～15]。从整体上探讨多个信号通路的网络调节作用乃至与周围环境因素的关系，更能够全面深刻地揭示机体作为一个整体面对不同遗传和环境压力作用下的不同反应。

　　【参考文献】

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