血管紧张素转换酶抑制剂联合奈达铂对鼻咽癌CNE2细胞的抑制作用

　　作者：莫正英1， 李志玖1， 梁清乐2 作者单位：(郧阳医学院附属1太和医院肿瘤科;2生命科学研究所,湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的:研究血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)联合奈达铂(NDP)在体外对鼻咽癌细胞生长的影响。方法:利用MTT比色法、流式细胞仪、RTPCR、免疫印迹及酶联免疫等方法测定不同组 (对照组、NDP组、ACEI组、NDP+ACEI组)对人鼻咽癌细胞CNE2生长、细胞周期及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。结果:单独NDP或ACEI不能抑制CNE2细胞生长，联合应用能明显抑制CNE2细胞生长和VEGF的表达。结论:ACEI和NDP联合抑制CNE2细胞增殖是通过抑制VEGF的表达实现的。

　　【关键词】 血管紧张素转化酶抑制剂;奈达铂;VEGF;CNE2

　　Inhibitory Effect of Angiotensinconverting Enzyme Inhibitor Combined with Nedaplatin on Human Nasopharyngeal Carcinoma CNE2 Cells MO Zhengying1,LI Zhijiu1，LIANG Qingle2 (1Department of Oncology;2 Institute of Life Science,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor combined with nedaplatin on the growth of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells in vitro.Methods The effects of ACEI combined with nedaplatin on cell proliferation,cell cycle and VEGF expression of CNE2 were detected with MTT assay,flow cytometry,RTPCR,Western blotting and ELISA,respectively.Results Neither NDP nor ACEI had significant inhibitory effect on the CNE2 growth,while the combined application had significant inhibitory effect on the CNE2 growth VEGF expression.Conclusion The proliferation of CNE2 could be inhibited with the combination of ACEI and NDP by inhibiting VEGF expression.

　　Key words:Angiotensinconverting enzyme inhibitor;Nedaplatin;VEGF;CNE2

　　抗肿瘤血管生成药是肿瘤学研究的热点之一[1]。动物模型已证实抗血管生成的复合物能成功抑制肿瘤发展，其中血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensinconverting enzyme inhibitor，ACEI)能减弱促血管生成药物效果[2]。奈达铂(Cisdiammineglycolatoo,o′platinum Ⅱ)是一种广谱、高效、低毒的新一代铂类抗肿瘤新药，其抗肿瘤作用优于顺铂。本实验旨在通过体外培养观察ACEI联合化疗药奈达铂(NDP)对人低分化鼻咽癌细胞株(CNE2)生长的影响，以探讨二者联合对肿瘤细胞周期的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　人低分化鼻咽癌细胞株CNE2购于武汉细胞典藏中心。奈达铂(Nedaplatin,NDP)是江苏奥赛康药业有限公司产品，血管紧张素转换酶抑制剂哌林多普利(Perindopril，PE，日本Daiichi制药公司)，RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亚砜(DMSO,Sigma公 司)，酶联免疫检测仪(BIORAD 550，美国伯乐公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)，Eppendorf PCR仪，ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,USA)。

　　1.2 实验分组

　　本实验共分为4个组，分别为对照组、奈达铂(NDP 1.6×10-6mmol/L)组、ACEI(1×10-6mmol/L)组、NDP+ACEI 组。

　　1.3 细胞培养

　　CNE2细胞在RPMI 1640完全培养基中培养(10%小牛血清)，于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化，用4 g/L台盼蓝染色后计算细胞存活率，细胞存活率达99%时进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×105/mL备用。

　　1.4 MTT比色法检测细胞活性

　　96孔板接种细胞，每孔104个，每组3个重复。24 h细胞完全贴壁后吸出每个孔的培养液，加入实验药物，培养0、12、24、36、48、72、84 h绘制细胞生长曲线。实验终止前4 h加入MTT液20 μL/孔，实验结束后吸取培养液，每空加入150 μL DMSO,平板震荡10 min，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定各孔吸光度OD值，然后绘制细胞生长曲线。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期

　　各组细胞培养24 h后，0.25%胰酶消化，含血清培养液终止，离心后PBS冲洗，重复2次，获取细胞，流式细胞仪分析细胞周期。

　　1.6 RTPCR检测VEGF mRNA表达

　　TRIZOL法提取4组总RNA，经紫外线分光光度定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定。取5 μg用于逆转录，方法按RTPCR(Invitrogen)试剂盒说明进行。引物设计：VEGF正义引物：5′CTG CTC TCT TGG GTG CAC TGG3′，反义引物：5′CAC CGC CTT GGC TTG TCA CAT3′,片段长度431 bp。βactin正义引物：5′CGT AAA GAC CTC TAT GCC AA3′，反义引物：5′AGC CAT GCC AAA TGT CTC AT3′，扩增产物为233 bp。

　　以βactin为内参，逆转录后行目的基因和βactin cDNA扩增。分别取逆转录产物2.5 μL用于PCR。 50 μL体系包括：10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上、下游引物各20 pmol，Taq DNA 0.4 μL ，模板cDNA 2.5 μL,灭菌水36.1 μL。PCR 条件：94 ℃预变性3 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min, 30次循环，72 ℃延伸10 min。PCR 产物置2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，电泳条带经电泳图像分析仪照相。

　　1.7 ELISA法检测VEGF在细胞中的表达

　　不同处理的细胞的VEGF表达水平用ELISA试剂盒检测，操作步骤按说明书提供。

　　1.8 统计学处理

　　所有资料均用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料的组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞生长曲线

　　与对照组相比，单独NDP或ACEI不能明显抑制肿瘤细胞的生长，但NDP+ACEI联合能明显抑制肿瘤细胞的生长(P<0.01)，见图1。

　　图1 不同处理条件的细胞生长曲线

　　注：实验组和对照组比较，*P<0.01。

　　2.2 细胞周期

　　各组细胞培养24 h后，NDP组细胞周期发生变化，NDP+ACEI组细胞周期无明显变化。NDP组和对照组比较，G2+M期细胞增殖百分数增加，而S期细胞增殖百分数变化不大。NDP+ACEI组和对照组比较，G1期细胞明显减少，而G2+M期细胞增殖百分数明显变大(P<0.05)，NDP+ACEI组与其对应的ACEI组比较，G2+M期细胞增殖百分数明显增加，而G1期细胞明显下降(P<0.05)。对照组与ACEI组、NDP组相比细胞增殖百分数无统计学意义(P>0.05),见表1。

　　2.3 VEGF mRNA 水平的表达

　　以βactin 为内参，ACEI+NDP 组与其它组比较，VEGF mRNA 表达水平明显降低，而单独的ACEI组或NDP组与对照组比较则无明显差异(P<0.05)，见图2。注：与对照组比较，*P<0.05,#P>0.05;与NDP组比较，◆P<0.05;与ACEI组比较，□P<0.05

　　2.4 细胞内VEGF的表达

　　与对照组比较，单独用NDP或ACEI均不能明显抑制VEGF在细胞中的表达，联合NDP和ACEI处理细胞则能明显的抑制VEGF的表达(图3)。

　　图3 不同药物处理的VEGF的表达

　　3 讨论

　　目前抗血管生成治疗在全球范围内仍处于研究阶段[3]。研究发现任何实体肿瘤如果没有新的自体血液供应都不能生长[4-5]，很多实验模型也已经证实针对肿瘤血管生长的治疗靶点是有效的[6]。但是单独使用一种抗血管生成药物并不能有效抑制肿瘤血管发生[7-8]，有一些临床病例表明传统的化疗药物联合抗血管生成药物能起到抗肿瘤的效果[9]。

　　血管紧张素转化酶(ACE)是一种存在于人体内皮细胞、上皮细胞、神经上皮细胞膜表面及血浆、体液中的金属蛋白酶，在人体内主要的作用为催化血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)转化为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)，同时将缓激肽等其他肽类激素分解为无活性片段。研究发现，血管紧张素转化酶抑制剂ACEI类药物具有抗肿瘤血管生成活性。ACEI通过抑制ACE活性，一方面减少ATⅡ生成，另一方面升高缓激肽水平，还能抑制金属蛋白酶及纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)活性，对肿瘤细胞的分化具有调控作用。Chen等[10]发现，卡托普利、依那普利能抑制SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞株摄取核素标记的胸腺嘧啶，抑制细胞增殖;Small等[11]应用卡托普利、赖诺普利抑制T470、Hs578T人乳腺癌细胞株增殖;Yasumatsu等[12]发现，培哚普利虽然并不直接抑制鼠鳞状上皮细胞癌细胞株、人口腔鳞状上皮细胞癌细胞株增殖，但培哚普利组显示出血管内皮细胞生长因子(VEGF)信使核糖核酸表达显著减少，并抑制VEGF表达启动子的诱导活性。

　　奈达铂对头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、宫颈癌等均有明显作用，其毒副作用小是一种广谱、高效、低毒的新一代铂类抗肿瘤新药。本实验中单独使用ACEI不能明显抑制肿瘤细胞的生长和VEGF的表达，可能是我们的用量较低,没有达到其抑制效应的临界值。因为ACEI对血管紧张素Ⅱ诱导的血管生成的抑制作用呈浓度依赖关系[13]。但联合使用ACEI和NDP则能明显抑制肿瘤细胞的生长和VEGF的表达，可能是由于两者联合能激活细胞内的某些信号通路而抑制肿瘤的生长，其中的机制尚需深入研究。NDP是一种重要的化疗药物，尽管一些化疗药在小剂量的时候也有抑制血管生成作用[14]，但本实验发现低剂量无明显抑制细胞的生长作用，表明其抑制肿瘤的效果并不是简单的对细胞毒性依赖，推测联合用药对肿瘤的抑制作用至少部分原因是通过抑制血管生成实现的，故联合应用ACEI 和NDP为今后鼻咽癌治疗提供了一个新的策略。

　　【参考文献】

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　　[14]Kerbel RS,Kamen BA.The antiangiogenic basis of metronomic chemotherapy[J].Nat Rev Cancer,2004,4(6):423-436