散发性卵巢癌中BRCA1基因突变的研究

　　作者：张竹强 岳秀兰 曹虹然 白雪峰 作者单位：包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014010

　　【摘要】 检测BRCA1基因第2外显子和第20外显子在散发性卵巢癌中的突变情况，探讨其与卵巢癌发病的关系。方法:采用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性分析)结合银染的方法，对36例无血缘关系的卵巢癌患者BRCA1基因第2、20外显子进行突变检测。 结果:在外显子2和20的序列中未发现有突变。 结论:在Ashkenazi犹太妇女中发现的两个突变热点185delAG和5382insC可能不是中国散发性卵巢癌患者的突变热点，说明外显子2和20上的序列对中国人群散发性卵巢癌发生的影响不大，有待于在中国散发性卵巢癌患者中寻找BRCA1基因的新的突变热点。

　　【关键词】 卵巢癌 BRCA1 PCR-SSCP

　　A Study on the Mutation of BRCA1 Gene in Sporadic Ovarian Carcinoma

　　ZHANG Zhuqiang1 ,YUE Xiulan1 ,CAO Hongran2 ,BAI Xuefeng2

　　(1.Department of Biochemistry, Baotou Medical College,Baotou 014010,China;

　　2.Department of Pathology,the Seventh Hospital)Abstract Objective:To detect the mutation in two exons of BRCA1 gene (first one and 20th one)in sporadic ovarian carcinoma, and to study the relationship between BRCA1 mutation and ovarian carcinoma. Methods: 36 patients with ovarian carcinoma without blood relationship were randomly selected and polymerase chain reaction(PCR) Single-strand conformational polymorphism(SSCP) was used to test the mutation of exons 2 and 20 of BRCA1. Results: No mutations were found in exons 2 and 20. Conclusion: 185 delAG and 5382 insC which were found to be high mutation sites in Ashkenazi Jewish women are not high ones in China. It is indicated that gene sequence of what we have studied doesn't account much for occurrence of the sporadic ovarian carcinoma in the population of China. It is important to find new mutations in the sporadic patients of ovarian carcinoma in China.Key wordsOvarian carcinoma;BRCA1;PCR-SSCP

　　BRCA1(breast and ovarian cancer susceptibility gene)基因是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其突变与30%~50%的家族性乳腺癌、卵巢癌有关，而且突变率与家族中具有乳腺癌和卵巢癌病史的人数呈正相关。研究表明，BRCA1基因胚系突变与几乎所有遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征相关，且主要在遗传性早发性卵巢癌中起作用[1]。而针对散发性卵巢癌中检测出BRCA1基因突变的报道并不多见，且其与散发性卵巢癌的关系仍不能确定。曾有研究表明，不到10%的散发性卵巢癌与BRCA1基因突变有关[2]，但其确切功能和作用机制尚不清楚。为了探讨散发性卵巢癌患者BRCA1的突变情况，本文采用PCR-SSCP结合银染的方法，检测了36例散发性卵巢癌患者BRCA1基因的突变情况。

　　1材料与方法

　　1.1 检测标本36例卵巢癌新鲜组织标本取自2005年1月至2006年9月间在包头市第七医院、包钢医院及内蒙古医学院第一附属医院住院手术的患者，经病理确诊均为卵巢癌,其中浆液性囊腺癌12例，黏液性囊腺癌7例，子宫内膜样癌9例，恶性畸胎瘤3例，颗粒细胞癌5例。年龄28~75岁，中位年龄46.5岁。按照FIGO国际妇产科联盟诊断标准，其中Ⅰ期0例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例，标本立即剔除血块及脂肪组织，置于-20℃冰箱中冷冻保存。取其中30例自身癌旁正常卵巢组织作对照。

　　1.2试剂与仪器PCR扩增反应体系试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自北京鼎国生物技术有限责任公司，引物合成由上海生工公司完成，提取DNA的试剂盒为上海生工生物工程公司产品。PCR仪(PE480)：The Perkin-Elmer Corporation;紫外透射反射分析仪：上海康禾光电仪器有限公司;DYCZ-24D型垂直电泳槽：北京六一仪器厂;TS-1脱色摇床：金坛市华峰仪器有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1DNA提取采用上海生工公司生产的SK1342临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒提取组织中DNA，作为PCR反应的模板。

　　1.3.2引物设计和合成根据文献报道[3]，在BRCA1可能存在突变热点的区域，选择该基因第2、20外显子合成2对引物，由上海生工生物工程公司合成。其中第一对引物用于特异性地扩增BRCA1基因序列(GeneBank.L78833)第4 557～4 814位的258个碱基，引物序列如下：上游引物5′-GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT -3′，下游引物5′- TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T-3′。第二对引物用于特异性扩增BRCA1基因序列第71 518～71 918位的401个碱基，引物序列如下：上游引物5′- ATA TGA CGT GTC TGC TCC AC-3′，下游引物5′- GGG AAT CCA AAT TAC ACA GC-3′。

　　1.3.3PCR反应体系及条件总反应体系25μL，内含DNA模板5μL，10mmol/L dNTP0.8μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL，Taq DNA聚合酶2U，上下游引物终浓度各为0.33μM，ddH2O补足反应体积至25μL。再加入无菌液体石蜡一滴。PCR循环参数：预变性95℃，2min;变性94℃，2min;退火55℃，1min;延伸72℃，36s，共35个循环。末轮循环72℃延伸5min。

　　1.3.4PCR产物鉴定取6μL PCR扩增产物并加入1μL溴酚蓝载样液，经1.5%含有EB的琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余的置于-20℃保存备用。

　　1.3.5单链构象多态性分析 取PCR扩增产物2μL,加4μL上样液(95%去离子酰胺，20mmol/L EDTA,0.05%二甲苯青，0.05%溴酚蓝)混匀后，沸水中变性10min，冰上骤冷5min，然后上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(acrylamide∶bis=29∶1)在1×TBE缓冲体系中电泳，75～80V，3～4h，直至二甲苯青接近凝胶底部为止。取出凝胶进行银染。

　　1.3.6银染 凝胶用硝酸银[4]染色，主要步骤如下：用ddH2O漂洗1min，在摇床上0.2%AgNO3染色液中轻摇6min，再用ddH2O漂洗1min，加少量预冷的显影液，轻摇10s，弃去反应液，加入200mL显影液(2%NaOH,0.04%NaCO3，0.4%甲醛)轻摇，直至背景呈淡黄色，用ddH2O漂洗至条带清晰。

　　2结果

　　2.1PCR扩增 36例卵巢癌BRCA1基因的2和20外显子的PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一条带，与对照组的相应片段长度一致，说明患者BRCA1基因在所检测的片段上没有明显的插入或缺失。见图1。

　　2.2SSCP分析结果将患者与对照组BRCA1基因外显子2和20的PCR产物分别进行SSCP分析，与同一胶中正常对照相比，单链DNA带出现泳动移位，多余条带或条带变宽者，视为异常条带。本实验检测36例无血缘关系的卵巢癌患者，在外显子2和20的序列中均未发现有突变。见图2。

　　3 讨论

　　1990年Hall等[5]用连锁分析的方法发现早发性家族遗传性乳腺癌的发生与染色体17q21的一个基因突变有关，并将其命名为BRCA1。1994年Miki成功地克隆此基因，从此对BRCA1的功能、突变情况及其与乳腺癌、卵巢癌发生关系的研究迅速深入开展起来。BRCA1基因组长约80kb，编码区5 711bp，包括24个外显子，其中22个外显子编码一个含1 863个氨基酸的蛋白质。大量的实验结果表明BRCA1作为一种抑癌基因，在正常卵巢上皮细胞核内起重要的转录调控作用，参与细胞周期的调节，抑制细胞增殖，促进细胞终末分化，诱导细胞凋亡和参与细胞DNA损伤修复，维持基因组的完整，是一个重要的细胞周期负调控子[6]。而BRCA1基因的突变则导致BRCA1编码的蛋白质从细胞核进入细胞质中，丧失了与DNA结合的能力。同时，BRCA1基因受雌激素的调控，具有组织特异性，其突变和低表达是诱发卵巢癌的主要原因之一[7]。

　　BRCA1是一个很大的基因，故发生的突变位点多。自BRCA1被克隆后，已发现100多种突变，它们分布于所有22个外显子及多个非表达片段中(内含子及mRNA剪切位点)，包括大多常见突变类型：错意突变、无意突变、移框突变、指环区突变及相应于BRCA1转录本数量减少/缺失的调整突变。在BRCA1全部突变类型中，以移框突变最为常见(占58%)，86%的突变发生截短蛋白的产物[8]。

　　BRCA1在遗传性乳腺癌、卵巢癌患者中的突变率最高约50%~100%，在卵巢癌和/或乳腺癌患者的1~3级亲属中突变携带率约10%~30%，而在普通人群中仅不到0.1%[9]。世界各地的资料所报道的BRCA1突变不尽相同，具有一定的种族地域差异，公认的4个突变热点是：外显子2的185缺失AG;外显子11的1 294缺失40，4 184缺失4;外显子20的5 382插入C，共约占整个胚系突变的28%[10]。

　　家族性卵巢癌患者易具有遗传倾向，BRCA1基因的突变以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。目前国外研究表明BRCA1基因与遗传性卵巢癌的关系密切，但与散发性卵巢癌的关系尚不清楚，而国内有关这方面的研究结论亦有争议。本实验选择了欧美家系研究结果显示的BRCA1基因的突变热点区域2和20外显子，利用PCR-SSCP方法检测中国散发性卵巢癌患者36例肿瘤组织的BRCA1突变情况。结果表明BRCA1基因外显子2和20上没有突变。国内目前针对卵巢癌中BRCA1基因的研究不多。我们的研究结果表明，中国人群的突变率明显低于欧美的研究结果。1995年Inoue等[11]人对日本18个乳腺癌家族及2个卵巢癌家族的研究，仅检测到2例乳腺癌存在突变，他们认为BRCA1在日本乳腺癌/卵巢癌家族中出现的机会少于西方,从而质疑BRCA1基因可能不是日本人家族性卵巢癌的易感基因。以上研究结果均提示东西方女性在卵巢癌发生机理上可能存在差异。本次实验结果显示BRCA1基因在中国卵巢癌患者中不存在Ashkenazi Jewish人群中常见的突变热点，可能在中国人群中它们不是突变的热点，而且可推测外显子2和20序列的突变对中国散发性卵巢癌患者的致病影响不大。

　　在分子水平研究卵巢癌的发病机制，寻找BRCA1检测的适宜方法，探讨BRCA1在卵巢癌发生发展中的作用，有助于建立可行的卵巢癌早期检测方法，指导临床治疗卵巢癌，进行卵巢癌遗传风险评估，从而达到改善卵巢癌预后的目的。结合本次实验，我们推测中国人群中卵巢癌由于不同的人种和环境因素，其发生机理与国外可能不同，故尚需扩大样本和检测范围来进一步研究。

　　现有检测BRCA1突变的方法有免疫组化法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)等，虽然操作简单易行，但存在一些技术上的局限性;此外还有变性高效液相色谱分析(DHPLC)和基因测序技术，但也存在着技术投资较大，运行成本较高等问题。而PCR-SSCP技术简单、经济，无需特殊试剂和设备，且条带清晰，结果稳定。PCR-SSCP是1989年由Orita等[12]结合PCR反应和单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳首先创立的。其基本原理是在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。这种构象由DNA单链碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用来维持。相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也就不同。靶DNA中如果含单碱基置换、碱基缺失或插入等改变时，就会因迁移率变化而出现泳动移位。PCR-SSCP分析具有需要样品量少、操作简便、费时较少、高灵敏度等优点，它可以检测点突变，也能检出插入或缺失突变，适合于多样品的筛选。DNA银染是利用银离子可与核苷酸结合的特性，在碱性环境下甲醛能使银离子还原从而使凝胶中的DNA得以显带的染色法。传统方法采用溴化乙锭(EB)染色，经紫外灯下观察，虽操作简便，但聚丙烯酰胺凝胶会熄灭EB荧光，故不能检出少于10ng的DNA分子，而且EB是强烈的癌诱变剂并污染环境，与之相比，银染可检测到低至1ng范围的核酸，具有可与同位素相比拟的高灵敏度，无致癌毒性，同时也消除了观测时紫外线对眼睛的伤害。目前，PCR-SSCP分析已被广泛用于癌基因、抑癌基因突变的鉴定，遗传病致病基因分析和基因诊断等领域。

　　单链构像多态性分析(single-strand conformation polymorphism,SSCP),属于凝胶转化实验中的一种[13]，在具有上述诸多优点的同时，也存在一些不足，如：不能检测出所有的变异，特别是当DNA片段大于200kb时，也不能检测出编码以外的变异，敏感性变化大，仅可作为一个初步筛选的手段。

　　【参考文献】

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　　[4] 苏丽娅，岳秀兰，曹虹然，等.散发性乳腺癌中BRCA1 基因突变的探讨[J].中国肿瘤临床杂志,2007，34(5)：289-290.

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　　[6] Sakorfas GH,Tsiotou. Genetic predisposition to breast cancer:a surgical perspective[J]. Br Surg,2000，87(2):149-162.

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