食管鳞状细胞癌中SDF-1的表达及DC抗肿瘤活性的影响

　　作者：乔辉 耿排力 作者单位：青海大学医学院

　　【摘要】 目的 探讨食管鳞癌中基质细胞衍生因子-1的表达与树突状细胞密度的相互关系及它们与患者临床病理特征的关系。方法 运用免疫组化和原位杂交方法检测49例食管鳞癌组织中基质细胞衍生因子-1蛋白和mRNA、S-100蛋白标记的树突状细胞的表达，根据染色面积和染色强弱判断它们表达的水平。结果 (1)肿瘤细胞分化和浸润深度与基质细胞衍生因子-1的表达呈正相关(rs分别为0.498、0.313，P<0.05);而与S-100蛋白阳性树突状细胞的密度呈负相关(rs分别为 -0.501、-0.466，P<0.05)。(2)基质细胞衍生因子-1与树突状细胞密度间存在负相关性(rs= -0.619,P<0.05)。结论 (1)基质细胞衍生因子-1蛋白的表达与食管鳞癌的临床病理特征存在明显相关性。(2)食管鳞癌中基质细胞衍生因子-1的表达可影响鳞癌组织中树突状细胞的密度，可能影响宿主的抗肿瘤能力及肿瘤的浸润转移。

　　【关键词】 食管肿瘤 基质细胞衍生因子 树突状细胞

　　SDF-1 EXPRESSION AND AFFECTION TOTHE ACTIVITY OF DC ANTI-TUMOR IN ESOPHAGEALSQUAMOUS CELL CARCINOMA

　　Qiao Hui , Geng Paili

　　(Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective To investigate the relationship between expression of SDF-1 and density of Dendritic cell (DC) in esophageal squamous cell carcinoma and their association with patients' clinicopathological features. Methods The expression of SDF-1 and DC in 49 specimens of esophageal squamous cell carcinoma was detected by immunohistochemical technique and in situ hybridization, using anti-SDF-1 monoclonal antibody, anti-S-100 monoclonal antibody and labeled SDF-1mRNA probes. The results were evaluated according to the staining area and intensity .Results (1) SDF-1 expression was actively associated with tumor grade ,depth(rs, respectively 0.498，0.313，P<0.05); There was a close negative relation between the density of S-100 positive DC and tumor grade ,depth (rs, respectively -0.501，-0.466，P<0.05).(2) There was a reverse correlation between the expression of SDF-1 and the density of DC (rs= -0.619,P<0.05). Conclusion (1)SDF-1 protein is associated with clinicopathological features of esophageal squamous cell carcinoma .(2) Expression of SDF-1 might affect the density of DC and can affect the immune system and the invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

　　Key words Esophageal squamous cell carcinoma Stromal cell-derived factor-1 Dendritic cell

　　基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是CXC趋化因子家族的一个成员，与造血干/祖细胞的动员和归巢关系密切，同时也是炎症细胞迁移的重要因子[1～2]，其在许多实体肿瘤中常呈异常表达[3]，并与肿瘤的浸润转移有关[4]。树突状细胞(dendritic cell,DC)是机体专职抗原提呈细胞，主要为T、B细胞提呈肿瘤细胞的抗原，从而诱导抗肿瘤的体液免疫应答和细胞免疫应答。有报道显示，恶性肿瘤组织中树突状细胞存在数量异常[5],且与SDF-1有一定关系[6]。因此，本研究着重探讨SDF-1、DC与食管癌病理特征的关系及SDF-1和DC表达的相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　选取2008年7月至8月在河南省安阳市肿瘤医院接受外科手术的49例食管癌患者手术标本。标本经10%福尔马林固定后，常规脱水包埋，制成石蜡标本(包括肿瘤组织49例和正常组织25例)，并收集患者临床病理资料。男性27例，女性22例;年龄，51至81岁，平均年龄(61.35±7.15)岁，其中>60岁，26例，≤60岁，23例;按肿瘤大小分组，>5cm,9例，≤5cm,40例;按肿瘤分化程度分组，Ⅰ级8例，Ⅱ级21例，Ⅲ级20例;按肿瘤浸润范围分组，黏膜层及黏膜下层(T1)5例，肌层(T2)12例，外膜(T3)32例;按淋巴结转移情况分组，N023例，N126例。

　　1.2 试剂

　　兔抗SDF-1多克隆抗体购自武汉博士德公司;兔抗S-100多克隆抗体购自北京中杉公司;SABC试剂、DAB显色剂及SDF-1原位杂交试剂盒均购自武汉博士德公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 免疫组化染色

　　SDF-1、S-100的检测均根据试剂盒提供方法操作。SDF-1以博士德公司提供的阳性切片作为染色的阳性对照，S-100用黑色素瘤标本作为阳性对照,二者都以PBS代替一抗作为每次染色的阴性对照。SDF-1染色结果判定：胞浆或胞膜含黄色颗粒者为阳性细胞。评分标准：将染色强度评分(无色为0 分;淡黄色为1 分;棕黄色为2 分;棕褐色为3 分) 和阳性细胞率评分( <5%为0分;5%～25%为1 分;25%～50%为2 分;50%～75% 为3 分; >75%为4分) 之积作为该病例评分值,将评分值分为0 分( - ，阴性) , 1 ～2 分( + ，弱阳性) ,3～6 分( + + ，阳性) , > 6 分( +++ ，强阳性)。S-100蛋白的表达：视分散地存在于肿瘤细胞之间的细胞浆被染成棕黄色的细胞为阳性[7] 。随机在癌周及癌间质区中DC的密集区, 计数5个高倍镜视野中的S-100阳性DC作为癌组织中S-100阳性DC的密度，少于 6个者为(+ ), 7～15个者为(++ ), 16个以上者为(+++)。

　　1.3.2 肿瘤组织SDF-1原位杂交

　　采用针对人SDF-1mRNA 3个不同区域的地高辛标记多相寡核苷酸探针。其序列为:(1) 5’-AGGTC GTGGT CGTGC TGGTC CTCGT GCTGA-3’;(2)5’-TCAAG CATCT CAAAA TTCTC AACAC TCCAA-3’;(3)5’-CAGG AGTA CCTGG AGAAA GCTTT AAACA AG-3’。检测按试剂操作说明进行，DAB显色。

　　1.4 统计学方法

　　应用SPSS10.0软件对实验数据进行分析，计数资料用χ2检验，等级资料两组间和多组间比较分别采用Wilcoxon、Kruskal-Wallis秩和检验，相关分析用Spearman等级相关分析，P<0.05表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 食管鳞癌中SDF-1蛋白和SDF-1mRNA的表达及其与鳞癌病理特征间的关系

　　SDF-1蛋白在正常组织均为阴性表达(图1)。SDF-1蛋白阳性表达：肿瘤细胞胞质和胞膜被染成棕黄色或棕褐色(图2)。食管鳞癌组织中SDF-1蛋白阳性表达率为75.51%(37/49)，SDF-1mRNA阳性率为34.69%(17/49，图3)，两者表达有差异(P<0.05)。SDF-1蛋白表达与临床病理特征的关系见表1。由表1可知，食管鳞癌组织中SDF-1蛋白表达在年龄>60岁和≤60岁两组间差异无统计学意义,在不同性别及肿瘤大小组差异亦无统计学意义。肿瘤细胞分化不同的3 组间,SDF-1 的表达有统计学差异(P<0.05) ,其中肿瘤分化Ⅱ级、Ⅲ级的患者SDF-1表达明显高于肿瘤分化Ⅰ级的患者;肿瘤的浸润深度不同的3 组中,SDF-1表达差异具有统计学意义(P<0.05) ,其中T3 组SDF-1的表达明显高于T1 组;淋巴结转移组阳性SDF-1的表达高于淋巴结阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 S-100蛋白阳性DC与食管鳞癌病理特征的关系

　　如表1所示，不同分化肿瘤间，S-100蛋白阳性DC密度有差异(P<0.05)，中、低分化组S-100阳性DC密度低于高分化组;不同浸润深度的肿瘤间，树突状细胞的密度也有显著差异(P<0.05)，浸润深度为T3组的DC密度明显低于T1、T2组。

　　2.3 食管鳞癌中SDF-1蛋白表达，S-100蛋白阳性DC密度与临床病理特征及二者的相关关系

　　SDF-1的表达与肿瘤浸润深度呈正相关(rs=0.313,P<0.05),与肿瘤分化程度也呈正相关(rs=0.498,P<0.05)，即癌组织浸润越深，分化程度越低，癌组织中SDF-1的表达越显著(表1)。

　　S-100蛋白阳性DC的密度与肿瘤浸润深度存在负相关(rs=-0.466，P<0.05)，也与肿瘤分化程度存在负相关(rs=-0.501,P<0.05,图4)，即癌组织浸润越深，分化程度越低，癌组织中S-100蛋白阳性DC的密度越低(表1)。

　　如表2所示，SDF-1蛋白表达与S-100蛋白阳性DC密度间呈负相关(rs=-0.619,P<0.05)，即SDF-1表达量上升者S-100阳性DC的密度降低。

　　3 讨论

　　3.1 食管鳞癌组织中SDF-1的表达对肿瘤浸润转移的影响

　　SDF-1基质细胞衍生因子, 为小分子量(8～10kd)细胞因子，属于趋化因子CXC亚家族,编码区含267 bp,编码89个氨基酸残基多肽，系统命名为CXCL12(CXCchemokine ligand-12)。分子结构为N端两个半胱氨酸(CY)之间被另一个氨基酸残基X所分隔。具有两种异构体SDF-1α和SDF- 1β，其调节表达方式和功能相似。临床研究表明基质细胞衍生因子SDF-1及其受体在促进肿瘤细胞的定向迁移中起着重要的作用[4，8]。迄今为止，SDF-1/CXCR4 生物学轴在肿瘤转移中的作用已分别在乳腺癌、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤等的研究中得到证实。但是在食管癌中报道较少。本研究中,食管鳞癌组织中SDF-1蛋白在肿瘤侵袭性前缘及侵袭性肿瘤细胞中呈强表达,而且转移组SDF-1阳性率高于未转移组,浸润发展至外膜层的鳞癌其SDF-1阳性率高于浸润至肌层或黏膜内癌,这提示食管鳞癌组织中SDF-1表达具有促进鳞癌浸润转移的作用。表1食管鳞癌组织中SDF-1、S-100+DC的表达与临床病理特征的关系表2食管癌组织中SDF-1的表达与S-100+DC密度的相关性S-100+DC密度例数SDF-1 表达

　　3.2 食管鳞癌中SDF-1与DC的关系

　　3.2.1 DC在食管鳞癌组织中的浸润

　　DC是体内功能最强大的抗原提呈细胞,也是惟一能激活静息型T细胞的抗原提呈细胞。这些DC均从造血前体细胞( hematopoetic progenitor cell, HPC)分化而来,在体内广泛分布,发挥着强大的免疫监视功能,与肿瘤的发生、发展及预后关系密切。在肿瘤组织中,DC是反映肿瘤局部免疫状态的标志,其浸润程度与肿瘤的浸润、转移及患者的生存期、预后等均有密切关系[9] 。本研究中，49例食管鳞癌组织中均见到DC浸润。分化Ⅲ级的DC的密度明显低于Ⅰ级和Ⅱ级。外膜层的DC的密度明显低于黏膜层和肌层，这表明树突状细胞的数量与局部抗肿瘤免疫的效能存在一定的关系。

　　3.2.2 食管癌组织中SDF-1对DC的影响

　　在肿瘤组织中, DC的密度很低,在少量的DC中又是以未成熟的DC占优势(未成熟和成熟DC均表达S-100)。而未成熟的DC不具有抗原提呈能力，无法将肿瘤细胞抗原提呈给T细胞，形成免疫耐受[10]。Zou W[6] 等发现,肿瘤细胞能分泌SDF-1, SDF-1能招募未成熟DC至肿瘤组织范围中,而且能抑制DC的迁移。有报道认为，SDF-1 不仅可以招募未成熟DC,改变其分布而且能诱导DC 细胞纤维化[11]。在消化道肿瘤中，血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)的表达与DC的数量呈负相关[12，13]，而SDF-1与VEGF之间有协同促进作用[14],因而推测SDF-1的表达与DC的数量间也应呈负相关性。本研究证实了这一点，说明食管鳞癌中SDF-1表达的强弱对DC的数量有影响。

　　本课题通过对食管鳞癌中SDF-1和DC各自与其临床病理特征的关系及二者的相关性的研究证实，SDF-1不但促进了肿瘤细胞的浸润转移，而且对DC还有影响，因此SDF-1可能成为食管癌鳞癌治疗的新靶点。

　　【参考文献】

　　[1]Arai A , Jin A , Yan W, et al . SDF-1 synergistically enhances IL-3-induced activation of the Raf-1/MEK/Erk signaling pathway through activation of Rac and its effector Pak kinases to promote hematopoiesis and chemotaxis[J]. Cell Signal,2005, 17(4): 497 - 506

　　[2] Kuhlmann CR , Schaefer CA , Reinhold L , et al . Signalling mechanisms of SDF-induced endothelial cell proliferation and migration[J]. Biochem Biophys Res Commun , 2005 ,335(4):1107 - 1114

　　[3] Balkwill F. The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4[J]. Semin Cancer Biol, 2004, 4(3): 171-179

　　[4] Taichman R ,Coopet C ,Keller E , et al . Use of the stromal cell-derived Factor-1/CXCR4 pathway in prostate cancer metastasis to Bone[J]. Cancer Res ,2002,62(6):1832-1837

　　[5] Kavanaugh DY, Carbone DP. Immunologic dysfunction in cancer[J]. Hematal-Oncol Clin North America, 1996, 10: 927 - 931

　　[6] Zou W, Machelon V, Coulomb - L ’Hermin A, et al. Stromal - derived factor - 1 in human tumors recruits and alters the function of plasmacytoid precursor dendritic cells[J]. NatMed, 2001, 7(12): 1339-1346

　　[7]张晓智, 安怀伦, 张学斌. 食管癌及其区域淋巴结中S-100 +树突状细胞的免疫组化研究[J]. 西安医科大学学报, 1998, 19(2): 215 -218

　　[8] Muller A ,Homey B ,Soto H , et al . Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J]. Nature ,2001 ,410 (6824) :50-56

　　[9] Tsujitani S, Kakeji Y, Watanabe A, et al. Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion and dendritic cells in relation to tumor invasion and lymph node metastasis in human gastric cancer[J]. Cancer, 1990, 66: 2012 -2016

　　[10] 金　姝. 树突状细胞在免疫耐受中的作用[J].现代免疫学，2004，24(2)：175-177

　　[11] Milliken D ,Scotton C ,Raju s , et al . Analysis of chemokines and chemokine receptor expression in ovarian cancer ascites[J]. Clin Cancer Res ,2002 ,8 (4) :1108-1114

　　[12] 王正昕,曹雪涛,张明徽,等. 肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨[J]. 中国免疫学杂志, 1999, 15(11): 509 -511

　　[13] 王正昕,张明徽,李　楠, 等. 胃癌组织中树突状细胞浸润及其表面分子表达的临床意义[J]. 第二军医大学学报, 2002, 23(3): 264 - 266

　　[14] Salvucci O ,Lei Y, Villalba S , et al . Regulation of endothelial cellbranching morphogenesis by endogenous chemokine stromal derived factor -1[J]. Blood ,2002 ,99(8) :703-2711