肿瘤特异性单克隆抗体与酵母β葡聚糖联合用于抗瘤免疫治疗的研究进展

　　作者：刘晶晶, Lacey Gunn, Richard Hansen, 严 俊 作者单位：(美国路易斯维尔大学肿瘤研究中心，肯塔基州 路易斯维尔 40202)

　　【关键词】 肿瘤特异性单克隆抗体 酵母β葡聚糖 抗瘤免疫治疗 研究进展

　　近年来提出了肿瘤特异性单克隆抗体(mAb)联合酵母β葡聚糖用于肿瘤治疗的作用模式。已经证实，巨噬细胞能摄取、加工微粒子或大分子质量的可溶性β葡聚糖，分泌活性物质，从而提高中性粒细胞补体受体3(complement receptor 3,CR3)水平，发挥对受iC3b调理的肿瘤细胞的杀伤作用。体内外试验证实，有效的抗瘤作用有赖于补体在肿瘤细胞上的沉积和激活，以及CR3在粒细胞上的表达。动物体内研究表明，肿瘤单克隆抗体联合酵母β葡聚糖的治疗策略，具有抑制肿瘤生长和提高患者生存期的效果。临床上也在开展β葡聚糖与抗表皮生长因子受体单克隆抗体联合治疗转移性结、直肠癌的研究。本文拟就β葡聚糖的结构、作用机制及其在人类肿瘤异种移植模型中的应用作简要介绍，并对应用β葡聚糖联合肿瘤特异性单克隆抗体治疗肿瘤的研究前景进行综述。

　　人源化肿瘤特异性单克隆抗体已广泛应用于肿瘤的治疗，其作用机制涉及对受体酪氨酸激酶活化的拮抗、肿瘤细胞凋亡的诱导和介导ADCC/CDC等免疫效应。然而，单克隆抗体疗法并非一概有效，即使对于那些表达高水平肿瘤抗原的患者，也大都需要与化疗药物结合来提高疗效[1]。在尽可能减少不良反应的前提下，肿瘤特异性单克隆抗体疗法已取得了最好的效果。我们在以往的研究中，已经证实了酵母β葡聚糖能提高肿瘤特异性单克隆抗体的抗瘤效能[2]，而且单独的β葡聚糖即具有相似的功效。进一步的研究证实，补体激活的单克隆抗体与β葡聚糖联合应用可导致CR3依赖的细胞毒作用(CR3DCC)。

　　β葡聚糖是生物应答调节物(BRMs)，在亚洲，其被用于肿瘤治疗已达40年之久[2]。体内外的研究表明，可溶性、低分子质量的β葡聚糖，可结合于CR3(CD11b/CD18，Mac1，αMβ2整联蛋白)受体。CR3结合于不同配体的能力取决于与CD11b的结合位点，CD11插入区域(I)的配体包括：补体激活的iC3b组分、细胞间黏附分子1(ICAM1)、纤维蛋白原、凝血因子X和肝素。凝集素样区域(LLD)定位于膜的邻近处，能结合β(1,3)键葡萄糖聚合物(β葡聚糖)等微生物多糖。CR3的双重联接导致了脱粒和细胞毒效应。肿瘤特异性单克隆抗体联合β葡聚糖的治疗策略，已应用于鼠类同基因肿瘤移植模型以及人结、直肠癌转移模型的干预研究[3,4]。

　　1 β葡聚糖的来源和结构

　　β葡聚糖是存在于许多植物和微生物中的一种多糖，包括燕麦、大麦、蘑菇、海藻、细菌和酵母菌等。不同来源β葡聚糖的结构、构象和生物活性不尽相同。燕麦和大麦的β葡聚糖的构象基本是线性的，系由β(1,4)糖苷键连接而成;蘑菇和真菌的β葡聚糖则系具有短β(1,6)糖苷键侧链的β(1,3)键主链[5]。结构的不同影响着β葡聚糖的生物活性，最近的一项研究显示，β葡聚糖的分子大小和复杂程度影响其与人类单核细胞之间的相互作用[6]。

　　1.1 微粒子β葡聚糖

　　葡聚糖微粒(WGPs)，是一种纯化的富含β葡聚糖球状物的空酵母细胞，直径一般为2～4μm。经口服施用的WGP能被胃肠的巨噬细胞吞噬并运送至脾和骨髓。吞噬了WGP的巨噬细胞可释放一些WGP小片段，因吞噬细胞没有葡聚糖酶，其吞噬WGP的作用涉及氧化依赖的途径。吞噬细胞释放的可溶性β葡聚糖是一活性成分，能提高中性粒细胞CR3水平，增强对iC3b调理的靶细胞的杀伤效应。此外，WGP可刺激巨噬细胞分泌TNFα、MCP1、IL6等细胞因子，发挥对固有免疫和获得性免疫的双重活化作用[7]。将口服的WGP注射人体内，可经历4个阶段：吞噬阶段、加工处理阶段、固有效应阶段和获得性效应阶段。

　　1.2 可溶性β葡聚糖

　　PGG葡聚糖是一种高度纯化的、水溶性的、中等大小(大约150 000)的三螺旋结构的葡萄糖聚合物，具有β(1,6)键侧链和β(1,3)键主链。临床前研究显示，PGGβ葡聚糖很大程度上促进了肿瘤特异性单克隆抗体调节的肿瘤免疫[4]。可溶性PGGβ葡聚糖可通过静脉给药，并能被巨噬细胞摄取。像WGP那样，巨噬细胞可将PGGβ葡聚糖分解成小分子生物活性片段，提高中性粒细胞CR3水平，有效杀伤iC3b调节的肿瘤细胞。PGGβ葡聚糖不会诱导其他葡聚糖制品所具有的前炎症反应。

　　2 β葡聚糖与特异性单克隆抗体联合抗瘤的免疫机制

　　CR3DCC是一种杀伤微生物的关键机制。抗体结合于微生物表面的抗原，便可活化补体使iC3b沉积于微生物表面，进而被淋巴细胞CR3有效识别，诱导发生CR3DCC。CR3DCC的诱导有赖于CR3对微生物表面iC3b和β葡聚糖的双重占有。由于哺乳动物细胞缺乏β葡聚糖，肿瘤细胞特异性抗体与瘤细胞的结合虽能搭建iC3b与淋巴细胞上CR3结合的构架，但不能有效介导CR3DCC。因此提出假设，抗肿瘤单克隆抗体与β葡聚糖联合给药，有可能提高杀瘤效应，且这一假说已在鼠类同基因肿瘤的研究中得以证实[8]。但是，在CR3缺陷的小鼠，β葡聚糖与抗肿瘤单克隆抗体的联合疗法不能取得明显疗效，这表明补体CR3在体内抗瘤效应中的重要性。

　　进一步的体内研究显示，PGG和WGPβ葡聚糖经巨噬细胞分解产生的片段在抗瘤方面也发挥着重要的作用。尽管巨噬细胞摄取PGG和WGPβ葡聚糖并不需要CR3，但两种形式β葡聚糖的非CR3依赖性摄取过程提示，在吞噬阶段可能发挥着与其他β葡聚糖受体的相互作用，如dectin1等。dectin1是表达于DC膜表面43 000的糖蛋白，系lectin的受体。已有的研究表明，dectin1是一种微粒子β葡聚糖(如酵母多糖)的受体。TLR2和(或)TLR6与dectin1受体结合所形成的复合物，是介导前炎性细胞因子产生的必要成分，如酵母多糖可刺激TNFα的产生。此外，不同来源的β葡聚糖可通过不同的途径发挥其生物活性。我们的研究结果显示，巨噬细胞释放的β葡聚糖活性片段，可以提高效应细胞引出肿瘤细胞CR3DCC效应的能力[9]。

　　早期的研究已经揭示，酪氨酸激酶在CR3DCC活性的调节方面发挥着重要作用[10]。蛋白激酶抑制剂染料、除锈霉素A，可通过β葡聚糖显著阻断CR3途径。在模拟CR3对β葡聚糖活化片段和抗CR3I区域单克隆抗体的双重作用时，发现这种双重作用能刺激酪氨酸激酶的磷酸化，并且磷酸化的酪氨酸激酶能与CR3受体一起被免疫共沉淀。这表明双重作用通过使酪氨酸激酶磷酸化而吸附于CR3的胞内侧。CR3的这种双重作用也增强了PI3激酶的活化。酪氨酸激酶抑制剂云鞣杉醇，能显著阻断在PI3激酶活化中双重作用的调节，提示PI3激酶的激活系酪氨酸激酶磷酸化的下游事件，PI3K抑制剂LY294002和云鞣杉醇可以抑制CR3DCC的发现证实了这一点，同时表明，酪氨酸磷酸化和继后的PI3K活化，是调节CR3DCC的重要因素。双重作用还可促使CR3移向脂质筏并与Lyn激酶相互作用，此外CD11b活化可使细胞支架重排，进而导致CR3向Lyn和富含LacCer脂质筏易位，有助于中性粒细胞的吞噬作用[11]。

　　3 β葡聚糖与特异性单克隆抗体的联合应用

　　3.1 临床前肿瘤移植模型的应用

　　鼠乳腺、肺和淋巴肿瘤模型的研究表明，β葡聚糖的免疫疗法可提高抗肿瘤单克隆抗体的治疗效果。为了推进其临床应用研究，建立了严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型，并植入人非小细胞性肺癌(NSCLC)细胞系NCIH23，应用PGGβ葡聚糖和表皮生长因子受体(EGFR)人源化单克隆抗体进行联合干预。结果显示，抗EGFR单克隆抗体能够结合肿瘤表面的EGFR，活化补体并导致iC3b在肿瘤细胞表面的沉积，发挥有效的抑瘤效应。EGFR广泛表达于结肠、直肠、肺、乳腺、胰腺、胃肠癌和黑色素瘤，与肿瘤的进程和预后相关，常提示预后不良。PGGβ葡聚糖与抗EGFR抗体联合干预在异种肿瘤移植动物模型中的有效应用，为高表达EGFR的肿瘤患者的治疗展现了希望。

　　此外，人类卵巢癌细胞系SKOV3，能够表达高水平的Her2/neu，人源化抗Her2/neu抗体能够活化人和鼠的补体，进而导致iC3b在肿瘤细胞的沉积。SKOV3细胞还能过表达衰变加速因子CD55，系膜结合的补体调节蛋白(mCRP)，其过度表达是肿瘤细胞逃避免疫监视众多机制中的一种。CD55过度表达影响补体的活化，使C5a的水平大幅度减少，导致向肿瘤浸润的效应性中性粒细胞的缺乏。β葡聚糖与抗CD55单抗的联合给药，有助于诱导CR3DCC的杀瘤效应。随着抗肿瘤单克隆抗体及其人源化的不断发展，β葡聚糖与单克隆抗体联合应用的实践也在不断扩展，诸如FDA批准的抗血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体(贝伐单抗)与β葡聚糖的联合应用等就是很好的范例[3,12]。

　　3.2 中性粒细胞是受β葡聚糖调节的抗瘤效应细胞

　　中性粒细胞的趋化物C5a，是在β葡聚糖作用下中性粒细胞向肿瘤浸润的关键。BLT1是一种白三烯B4的受体，白三烯B4具有维持C5a诱发的中性粒细胞浸润肿瘤的能力。免疫组化分析表明，Ca5受体和(或)BLT1的缺乏可降低肿瘤组织中性粒细胞的含量。

　　中性粒细胞杀伤癌细胞的机制需重新评估。活化的中性粒细胞能够吞噬病原体，释放杀菌酶，活化穿孔素和NADPH氧化酶复合体。最近的研究表明，中性粒细胞诱导的TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)在其调理杀瘤的过程中发挥重要作用。在对白色念珠菌的研究发现，酵母菌细胞壁的β葡聚糖是诱发中性粒细胞抗真菌的关键因素。一旦CR3结合了酵母菌表面的β葡聚糖，则芽生孢子将被吞噬，而当菌丝占优势时，β葡聚糖将被中性粒细胞结合并导致呼吸爆炸。中性粒细胞的吞噬作用还与活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的增加密切相关，这在中性粒细胞发挥抗体依赖性杀伤作用时也得以证实[13]。

　　由此可见，中性粒细胞的杀菌和杀瘤作用涉及诸多方面。例如，缺乏呼吸爆发作用的中性粒细胞仍具杀伤恶性淋巴细胞的能力，这表明在不同的条件或情况下，中性粒细胞可表现出相异的功能。动物肿瘤模型研究显示，中性粒细胞ROS的生成对杀伤癌细胞是必须的;而人中性粒细胞参与的ADCC介导的肿瘤细胞杀伤作用，不依赖呼吸爆发或NADPH氧化酶活化，且尽管发现中性粒细胞与肿瘤细胞的直接接触，也未发现穿孔蛋白的杀瘤证据，这种ADCC效应被证实与诱导瘤细胞的凋亡相关，即抗体依赖的粒细胞调节的细胞毒性癌细胞凋亡，是β葡聚糖和抗肿瘤单克隆抗体结合疗法的理论依据。

　　3.3 β葡聚糖治疗的其他益处

　　在单克隆抗体治疗癌症时，PGG β葡聚糖的加入能在不给患者带来不良反应的情况下增加治疗效果，显示了良好的应用前景。此外，还有研究表明，β葡聚糖不仅有助于肿瘤治疗，而且在放疗和化疗后能促进骨髓造血细胞的恢复[14]。放化疗后可观察到iC3b在骨髓间质细胞上的沉积，其和β葡聚糖一起促进CR3+造血祖/干细胞(HPSCs)的增殖。体内外的研究均显示，PGGβ葡聚糖能增进鼠类和灵长类的髓细胞生成。在PGGβ葡聚糖调节的HPSC动员时，与应用粒细胞集落刺激因子(GCSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)相比，PGGβ葡聚糖无诱导促炎细胞因子的作用[15]。

　　4 面临的机遇与挑战

　　基于中性粒细胞CR3DCC的新机制，β葡聚糖与抗肿瘤单克隆抗体的协同作用，不会影响抗肿瘤单克隆抗体的其他杀伤机制。任何具有活化补体作用的抗肿瘤单克隆抗体，都能够与β葡聚糖联合用于肿瘤治疗。除了当前FDA批准的抗肿瘤单克隆抗体(如贝伐单抗等)外，已经开发出来用于治疗肿瘤的单抗还有抗CEA抗体、抗碳脱水酶IX抗体等。抗肿瘤单抗种类的日益增加，为设计β葡聚糖联合疗法提供了更多的机会。那些可刺激机体产生非保护性抗体应答的疫苗，虽不能诱导有效的抗瘤应答，但其与β葡聚糖联合应用便可通过抗体对补体的活化作用，诱导CR3DCC抗瘤应答。相对于单独肿瘤疫苗应用产生的获得性抗瘤免疫而言，肿瘤疫苗与β葡聚糖的结合尚可增加固有免疫的效果，在β葡聚糖调节的肿瘤治疗初期，启动中性粒细胞参与的固有免疫应答，同时也不失其抗瘤获得性免疫，可有效地将固有免疫和获得性免疫结合在一起[16]。

　　β葡聚糖和抗肿瘤单克隆抗体结合疗法也面临一些挑战。一个成功的β葡聚糖结合疗法，需要活化补体、iC3b的沉积以及趋化物C5a的释放，以不断补充效应中性粒细胞。然而在一些肿瘤，如SKOV3卵巢肿瘤，肿瘤细胞可因膜结合的补体调节蛋白(mCRP)过度表达而影响补体调节的细胞毒作用，逃避免疫监视。因此，在应用β葡聚糖和抗肿瘤单克隆抗体结合疗法时，应考虑这一因素。抗mCRP单抗的补充，可提高上述肿瘤治疗的成功率。进一步设计其他减少mCRP表达的策略十分必要，这包括小干扰RNA和调低mCRP的抗敏感探针的研制和应用、下调mCRP的化疗药物或细胞因子的使用以及最近新提出的抑制膜结合补体调节器(mCR)基因表达的方法等。既然补体的活化和iC3b在肿瘤的沉积是必需的，维持肿瘤相关抗原(TAA)的稳定表达也成为有效应用结合疗法的一种新思路。正如在其他免疫疗法所观察到的那样，基因组的不稳定是肿瘤的一种特征，在肿瘤组织中伴有潜在表达TAA的细胞异质群，因此任何单一的治疗方案实际上是一种片面的选择，敏感的细胞能被有效杀死，但具抵抗性的变异体被筛选出来并继续增殖。由此可见，成功的抗癌治疗依赖于多种措施的结合，β葡聚糖与抗瘤单抗的联合应用即是基于这一理念的新策略，动物实验已显示良好的前景。 PGG β葡聚糖联合抗EGFR单抗，在转移性结、直肠癌的临床研究中显示了令人鼓舞的结果[17]。更多测试其治疗肿瘤效果的临床调查正在进行之中。

　　【参考文献】

　　[1] Sobrero AF, Maurel J, Fehrenbacher L, et al. EPIC: phase III trial of cetuximab plus irinotecan after fluoropyrimidine and oxaliplatin failure in patients with metastatic colorectal cancer[J]. J Clin Oncol,2008, 26(14):2311-2319.

　　[2] Yan J, Allendorf DJ, Brandley B. Yeast whole glucan particle (WGP) betaglucan in conjunction with antitumour monoclonal antibodies to treat cancer[J]. Expert Opin Biol Ther, 2005,5(5): 691-702.

　　[3] Li B, Allendorf DJ, Hansen R, et al. Combined yeast betaglucan and antitumor monoclonal antibody therapy requires C5amediated neutrophil chemotaxis via regulation of decayaccelerating factor CD55[J]. Cancer Res,2007, 67(15):7421-7430.

　　[4] Salvador C, Li B, Hansen R, et al. Yeastderived betaglucan augments the therapeutic effcacy mediated by antivascular endothelial growth factor monoclonal antibody in human carcinoma xenograft models[J]. Clin Cancer Res, 2008,14(4):1239-1247.

　　[5] Yan J, Vetvicka V, Xia Y, et al. Critical role of Kupffer cell CR3 (CD11b/CD18) in the clearance of IgMopsonized erythrocytes or soluble betaglucan[J]. Immunopharmacology, 2000,46(1):39-54.

　　[6] Nisini R, Torosantucci A, Romagnoli G, et al. Betaglucan of Candida albicans cell wall causes the subversion of human monocyte differentiation into dendritic cells[J]. J Leukoc Biol, 2007, 82(5):1136-1142.

　　[7] Li B, Cramer D, Wagner S, et al. Yeast glucan particles activate murine resident macrophages to secrete proin.ammatory cytokines via MyD88 and Syk kinasedependent pathways[J]. Clin Immunol, 2007,124(2):170-181.

　　[8] Hong F, Hansen RD, Yan J, et al. Betaglucan functions as an adjuvant for monoclonal antibody immunotherapy by recruiting tumoricidal granulocytes as killer cells[J]. Cancer Res, 2003, 63(24):9023-9031.

　　[9] Saijo S, Fujikado N, Furuta T, et al. Dectin1 is required for host defense against Pneumocystis carinii but not against Candida albicans[J]. Nat Immunol, 2007, 8(1):39-46.

　　[10] Li B, Allendorf DJ, Hansen R, et al. Yeast betaglucan amplifies phagocyte killing of iC3bopsonized tumor cells via complement receptor 3Sykphosphatidylinositol 3kinase pathway[J]. J Immunol, 2006, 177(3):1661-1669.

　　[11] Nakayama H, Yoshizaki F, Prinetti A, et al. Lyncoupled LacCerenriched lipid rafts are required for CD11b/CD18mediated neutrophil phagocytosis of nonopsonized microorganisms[J]. J Leukoc Biol, 2008,83(3):728-741.

　　[12] Macor P, Tedesco F. Complement as effector system in cancer immunotherapy[J]. Immunol Lett, 2007,111(1):6-13.

　　[13] Horner H, Frank C, Dechant C, et al. Intimate cell conjugate formation and exchange of membrane lipids precede apoptosis induction in target cells during antibodydependent, granulocytemediated cytotoxicity[J]. J Immunol, 2007, 179(1):337-345.

　　[14] Cramer DE, Allendorf DJ, Baran JT, et al. Betaglucan enhances complementmediated hematopoietic recovery after bone marrow injury[J]. Blood, 2006, 107(2):835-840.

　　[15] Cramer DE, Wagner S, Li B, et al. Mobilization of hematopoietic progenitor cells by yeastderived betaglucan requires activation of matrix metalloproteinase9[J]. Stem Cells, 2008, 26(5):1231-1240.

　　[16] Baran J, Allendorf DJ, Hong F, et al. Oral betaglucan adjuvant therapy converts nonprotective Th2 response to protective Th1 cellmediated immune response in mammary tumorbearing mice[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2007, 45(2):107-114.

　　[17] Liu J, Gunn L, Hansen R, et al. Combined yeastderived βglucan with antitumor monoclonal antibody for cancer immunotherapy[J]. Exp Mol Pathol, 2009, 86(3):208-214.