LMP-1、VEGF在非角化性鼻咽癌中的表达及其意义

　　作者：王燕，陈莉 作者单位：1南通大学附属医院放疗科， 南通 226001; 2南通大学医学院病理教研室

　　【摘要】 目的：探讨潜伏膜蛋白(LMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)在非角化性鼻咽癌(NK-NPC)中的表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学技术(ENVISION二步法)，检测60例鼻咽癌组织中LMP-1、VEGF蛋白的表达，并分析其与癌预后的相关性。结果：(1)NK-NPC中LMP-1、VEGF的表达显著高于鼻咽慢性黏膜炎症组织(P<0.05);(2)NK-NPC中，LMP-1表达强度与有无远处转移密切相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、T分期、N分期无显著相关性(P>0.05);(2)NK-NPC中，VEGF表达强度与淋巴结转移，远处转移密切相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、T分期均无显著相关性(P>0.05);(3)NK-NPC中LMP-1与VEGF的表达呈正相关关系(P<0.05);(6)单因素Kaplan-meier生存曲线分析LMP-1、VEGF表达与NK-NPC的生存率之间的相关性有显著统计学意义(P<0.05)。结论：LMP-1和VEGF可作为诂价NK-NPC预后的指标之一。

　　【关键词】 非角化性鼻咽癌;潜伏膜蛋白(LMP-1);血管内皮生长因子(VEGF)

　　Study on the expression and significance of LMP-1 and VEGF in non-keratin

　　nasopharyngeal carcinoma

　　1WANG Yan，2CHEN Li (1Department of Radiation Oncology， Affiliated Hospital of Nantong University， Nantong 226001;2Nantong University)

　　[Abstract] Objective：To investigate the expression and its clinical significance of latent membrane protein-1( LMP-1) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in non-keratin nasopharyngeal carcinoma(NK-NPC). Methods: 60 biopsy specimens of clear pathological diagnosis with NK-NPC were treated by immunohistochemical techniques (Envison two-step).The expression of LMP-1 and VEGF protein in the tissue were examined and the whole-process radiotherapy of all cases was conducted and followed up for more than 3 years. (1) The positive expression rate of LMP-1 and VEGF in NK-NPC was 83% and 76% respectively，which were significantly higher than 20% and 30% in chronic nasopharyngitis(P<0.05). (2)The LMP-1 expressions in NK-NPC were positively correlated with distant metastasis(P<0.05)，while no significant differences were observed in sex，age，tumor stages and lymph node metastasis(P>0.05).(3) The VEGF expressions in NK-NPC were positively correlated with lymph node metastasis and distant metastasis(P<0.05)，while no significant differences were observed in sex，age， and tumor stages. (5) There were significant correlations between LMP-1 and VEGF expression (P<0.05). (6) The analysis of single factor revealed that the expressions of LMP-1， VEGF were significantly related with the prognosis of NK-NPC patients (P<0.05). Conclusions：LMP-1 and VEGF may be indexes for NK-NPC prognosis.

　　[Keywords] Non-keratin nasopharyngeal carcinoma; Latent membrane protein-1; Vascular growth factor; Clinical pathological factors

　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤，有颈淋巴结转移早，远处转移发生率高的特点。放射治疗是NPC的首选治疗方法，近20年来，放射治疗技术的改进和临床经验的积累，早期无远处转移的鼻咽癌5年生存率可达到80%以上[1]，特别是非角化性鼻咽癌(NK-NPC)对放疗较为敏感，但晚期NPC 5年生存率仍徘徊于30%~50%，治疗失败的主要原因是远处转移和局部复发[2] ，病灶发展难以控制。

　　本研究选取放疗敏感的NK-NPC 60例，应用免疫组织化学(Envison二步法)检测组织中潜伏膜蛋白(LMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况，分别分析LMP-1、VEGF的不同表达水平与NK-NPC临床病理因素之间的关系，与患者的放疗后生存率的关系。为临床提供对NK-NPC诊断与预后判断有价值的指标，尽早采取靶向干预治疗。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例来源 南通大学附属医院1999年5月~2003年5月间通过间接鼻咽镜活检病理诊断为NK-NPC标本60例，全部病例血清学检查EBV阳性，所有病例诊断后均经根治性放疗，6MV-X线常规分割，鼻咽照射剂量Dt 60~80 Gy/6~8周，阳性颈淋巴结Dt 64~70 Gy/6~7周。随访期36~74月，末次随访时间2006年12月，随访内容包括体检、间接鼻咽镜检查、鼻咽CT或磁共振、胸部X片、肝脏B超、同位素骨扫描、血生化检查。随访中共发现远处转移者24例，其中骨转移12例，肺转移5例，肝转移2例，其他部位转移5例。60例NK-NPC临床资料完整，男44例，女16例，患者年龄18~79岁，中位年龄53岁。根据临床检查、影像学检查与病理检查判断局部淋巴结与远处转移。抽取10例同期病理诊断为鼻咽慢性黏膜炎的组织作为对照。

　　1.2 主要试剂 鼠抗单克隆抗体LMP-1， 为 Neomarkers公司产品，购自上海晶美生物工程有限公司;鼠抗单克隆抗体VEGF、高分子量角蛋白CK5抗体、ENVISION试剂盒、抗体稀释液均购自北京中山生物技术公司。

　　1.3 免疫组化步骤 切片脱蜡至水，PBS冲洗，按照每种一抗的要求进行预处理;抗原修复：用柠檬酸盐缓冲液，微波中火10 min，流水自然冷却;0.5%胰蛋白酶酶消化室温15 min;每张切片加1滴(50 μl)3%的H2O2，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗;除去PBS液，每张切片加1滴第一抗体 ，分别用抗体稀释液进行稀释;在室温下孵育1 h，PBS冲洗;除去PBS，每张切片加1滴聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min， PBS冲洗;除去PBS每张切片加1滴抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min，PBS冲洗;除去PBS液，每张切片加一滴新鲜配制的DAB，室温下显色5 min，镜下控制染色，蒸馏水冲洗( 此过程均在自动免疫组化染色仪中按照事先编好的程序完成)。从自动免疫组化染色仪中取出已染色完毕的切片，苏木素轻微复染，0.1% HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

　　1.4 免疫组化染色结果判断[4] LMP-1、VEGF染色结果的判断： 观察染色切片并计数5个具有代表性的高倍视野，分别计数200个肿瘤细胞中阳性细胞(细胞质或核呈棕黄色)占比，并按其比例分级：阴性(-)，肿瘤细胞阳性数10%以下;弱阳性(+)，肿瘤细胞阳性数11%~25%;阳性(++)，肿瘤细胞阳性数>26%但<50%;强阳性(+++)，肿瘤细胞阳性数>50%(图1，2)。

　　1.5 按照2002年UICC分期标准进行分期[5] T1 7例，T2 15 例，T3 25 例，T4 13例;N0 12 例，N1 23 例，N2 22 例，N3 3 例。

　　1.6 统计学方法 使用Stata7.0统计软件采用χ2检验、等级相关检验，P<0.05示差异有统计学意义;生存率估计采用 Kaplan-Meier法描绘生存曲线。

　　2 结 果

　　2.1 鼻咽慢性黏膜炎及NK-NPC中LMP-1、VEGF阳性表达 在10例鼻咽慢性黏膜炎中LMP-1、VEGF阳性表达率分别为20%(2/10)， 30%(3/10)，而在60例NK-NPC中LMP-1 、VEGF、阳性表达率分别为83%(50/60)， 76%(46/60)。两指标在炎症和癌中表达阳性率和阳性强度的差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 在NK-NPC中LMP-1、VEGF表达与临床病理参数间的关系 NK-NPC组织中LMP-1蛋白的表达与NK-NPC患者的年龄、性别、肿瘤分期、有无淋巴结转移无关(P>0.05)，但和远处转移成正相关(P<0.05);NK-NPC组织中VEGF蛋白的表达与鼻咽癌患者的年龄、性别、肿瘤分期无关(P>0.05)，但和淋巴结转移、远处转移成正相关(P<0.05)。见表1。

　　2.3 NK-NPC组织中LMP-1与VEGF表达的相关性分析 VEGF 46例阳性中有44例LMP-1表达阳性，两指标符合率为95.65%，相关系数为0.4964(P<0.05)，说明在 NK-NPC中LMP-1、VEGF两指标呈显著正相关。

　　2.4 因慢性炎组织中有20%~30% LMP-1、VEGF的低表达，因此对NK-NPC预后分析将(-)和(+)组合并为低表达组以排除炎症反应引起的表达。把(++)与(+++)组定为高表达组， 作生存曲线(Kaplan-meier曲线)分析见图3、4。单因素生存分析结果显示LMP-1 、VEGF阴性表达或低表达者生存期长，高表达组生存期短(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　LMP-1是EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)表达的具有转化特征的病毒蛋白，生物学功能广泛，涉及细胞转化、增殖、凋亡和分化的各个方面[6]。体外实验表明LMP1能诱导转基因小鼠皮肤表皮增生，并可抑制表皮细胞的终末分化[7]。提示EBV-LMP1在上皮细胞肿瘤发生发展中起一定作用。

　　本研究显示， LMP-1在NK-NPC中的表达水平显著高于鼻咽黏膜慢性炎症组织(P<0.05)，这一结果说明NK-NPC发生与 EB病毒感染关系密切，与各文献报道的LMP-1在NPC中高表达一致[8]。陈莉等检测50例NPC显示颈淋巴结转移组中LMP-1表达强度显著高于无转移组[9]。Sheen等[10]发现在NPC复发组中LMP-1阳性率为77.8%，而在鼻咽局部控制组中LMP-1阳性率为20.0%。在本研究中，NK-NPC有淋巴结转移组的LMP-1阳性表达率高于无淋巴结转移组，随着肿瘤分期的升高，LMP-1阳性表达率增加，但差异未达到统计学意义。把肿瘤按有无颅底破坏分成 T3-4(有颅底破坏组)和T1~2(无颅底破坏组)，LMP-1在有颅底破坏组的阳性表达率高于无颅底破坏组(P<0.05)，提示NK-NPC中LMP-1的高表达与癌的侵袭转移有关，可增强癌细胞与基底膜的粘附能力、运动能力及侵袭能力。预后分析发现LMP-1低表达者生存时间长，而高表达者生存时间短(P<0.05)，提示LMP-1能预测NPC转移风险，表明LMP-1是评价NK-NPC预后的有效指标。

　　VEGF又称血管通透性因子(vascularpene-trating factor，VPF)，是一种功能强大，且能产生多种生物效应的细胞因子。正常情况下，VEGF仅在少数组织中(如肺泡表面，肾小球，肾皮质，心肌细胞)有表达，而多种肿瘤组织的VEGF表达明显高于正常组织。大量研究表明VEGF与NPC微血管密度(MVD)存在密切关系。Wakisaka N等[11]以VWF作为血管内皮标志物，用免疫组化法测MVD和VEGF，发现两者在NPC中存在正相关并在淋巴结转移中扮演着重要角色。研究还发现，多种基因和细胞因子能促进NPC血管生成，其主要的机制是通过上调VEGF表达来实现的。Jaeckel EC[12]报道，COX-2的肿瘤血管生成作用与VEGF有关，COX-2的抑制剂可使LMP-1阳性的NPC细胞VEGF表达减少。许新华等[13]报道，NPC组织中存在COX-2高表达，COX-2通过上调VEGF表达而促进NPC新生血管形成，进而促进NPC进展，影响其预后。赵素萍[14]等报道VEGF在NPC中的表达对预测NPC颈淋巴结转移、复发及评估预后有一定意义。

　　本研究采用免疫组化方法检测VEGF(主要是VEGF165亚型)在NK-NPC和鼻咽慢性黏膜炎症组织中表达情况，结果发现，VEGF在NK-NPC中的表达水平显著高于鼻咽黏膜慢性炎症组织(P<0.05)，VEGF阳性表达率在NK-NPC颈淋巴结转移和无颈淋巴结转移组分别为88%和68.6%，远处转移与无远处转移组分别为85.5%与41.7%，两组间差异有统计学意义(P<0.05)，VEGF高表达与NPC颈淋巴结转移关系密切，且更容易出现远处转移。单因素生存分析显示VEGF低表达组生存时间长于VEGF高表达组，因此在NK-NPC组织中检测到VEGF高表达常提示患者预后不良。

　　谭永年[15]等利用稳定细胞系和tet-on-LMP1-HNE2细胞系进行的研究表明，LMP-1无论是在稳定细胞系还是可控表达细胞系，VEGF能够随LMP-1的表达而表达，证实LMP-1在NPC细胞中可以调控VEGF的表达。本研究显示，LMP-1、VEGF在NK-NPC中的表达显著相关，认为EB病毒编码的LMP-1能够通过多种途径调控VEGF的表达，这两种基因在NK-NPC进展中存有协同作用，从而参与NPC细胞的侵袭与转移。

　　本研究采用单因素生存分析表明LMP-1、VEGF的表达与生存时间负相关，阴性表达或低表达者生存期长，高表达组生存期短，差异有统计学意义，综上所述，LMP-1和VEGF可作为NK-NPC预后判断的参考指标之一。

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