HIV1型病毒蛋白R基因表达载体的构建及其在前列腺癌细胞系PC3中的表达

　　作者：樊卫飞1， 王子盾2， 王 平2， 刘 平1， 卢 春2 作者单位：(南京医科大学 1.第一附属医院肿瘤科;2.微生物学与免疫学系， 江苏 南京 210029)

　　【摘要】 目的： 利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV1 病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC3，并在其中表达Vpr。方法： 自表达载体pCIneoVpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackVpr，经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后，利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒，经Pac Ⅰ酶切后回收大片段，并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达。收集第一代重组病毒上清，使之感染AD293细胞得到第二代病毒，如此反复感染AD293细胞3～4轮，使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后，分别以感染复数(MOI)为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC3，荧光显微镜观察细胞中GFP表达，并利用RTPCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果： 经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒，滴度为3.0×108 efu/ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24 h后，80%以上的靶细胞能够表达GFP，RTPCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论： 成功构建含Vpr基因重组腺病毒，并且病毒能够有效感染PC3细胞，使得目的基因在其中获得大量表达，为进一步研究Vpr蛋白对PC3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。

　　【关键词】 重组腺病毒; HIV1型病毒蛋白R; PC3细胞

　　Construction of the recombinant expression adenovirus vector carrying

　　HIV1 viral protein R gene and its expression in PC3 cell line

　　FAN Weifei1, WANG Zidun2, WANG Ping2, LIU Ping1, LU Chun2

　　(1.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital; 2.Department of Microbiology and Immunology, Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu 210029, China)

　　[Abstract] Objective: To construct the recombinant adenovirus containing HIV1 viral protein R (Vpr) gene, and investigate the expression of Vpr protein in PC3 cells. Methods: The fragment of Vpr gene from expression vector pCIneoVpr was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV. With the backbone plasmid pAdEasy1 and the Pme Ⅰ linearized shuttle plasmid pAdTrackVpr, the recombinant adenoviral plasmid was generated from the homologous recombination in the E.coli BJ5183. The adenoviruses were packaged in the AD293 cells by transecting the Pac Ⅰ linearized recombinant adenoviral plasmid, and were amplified by infecting AD293 cells, repetitively for 3-4 rounds. Then the viral titer was evaluated by green fluorescent protein (GFP) under fluorescence microscope. After infecting the PC3 cells with the recombinant adenovirus at MOI of 1, 5 and 10, the mRNA and protein expression of Vpr in PC3 cells was detected by RTPCR and Western blot, respectively. Results: Confirmed by the restriction enzyme digestion analysis, the recombinant adenovirus vector carrying Vpr was constructed successfully with the viral titer 3.0×108 efu/ml. And more than 80% PC3 cells could be infected by the adenovirus at the MOI of 5. In addition, the expression of Vpr in PC3 cells infected with AdEasyGFPVpr was detectable by RTPCR and Western blot. Conclusion: Recombinant adenoviruses with high titer and efficient infection of PC3 cells could be obtained quickly and simply by using AdEasy system, and Vpr expression could be observed in PC3 cells infected with AdEasyGFPVpr. The results of this study lay the foundation for further studying on the role of Vpr protein in its antitumor activity and related signaling pathways.

　　[Key words] recombinant adenovirus; HIV1 viral protein R; PC3 cell

　　前列腺癌是最常见的男性恶性肿瘤，近来由于筛查制度的不断完善，世界范围内前列腺癌的检出率呈增高趋势。在美国，前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为首位危害男性健康的恶性肿瘤[1]。在前列腺癌的治疗方面，虽然方法多样，但鉴于各自局限性，仍迫切需要一些更先进的治疗方法或更有效的治疗药物。近年来，应用某些病毒特异性基因产物作为肿瘤治疗手段，已成为研究的热点[2]。某些病毒基因产物，在脱离病毒基因组裂解复制体系后，仍可发挥部分生物学活性，从而具有作为肿瘤治疗手段的可能性[3]。

　　人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV1)病毒蛋白R(viral protein R，Vpr)是HIV1的一个辅助蛋白，由96个氨基酸组成，相对分子质量15 000。它可以与诸多细胞和病毒的蛋白相互作用，参与HIV1致病过程[4]。同时，作为一种游离蛋白质，Vpr具有将细胞停滞于G2/M期，并刺激快分裂细胞进入凋亡的功能[5,6]。体外实验也证明，Vpr可以抑制多种肿瘤细胞系的增殖[7，8]，且抗肿瘤作用不依赖于p53的表达水平[9]，使得Vpr在杀伤肿瘤细胞的同时不会对正常细胞造成明显的细胞毒作用[10]。

　　本实验构建了包含HIV1 Vpr基因的重组腺病毒，使其在前列腺癌细胞系PC3中成功表达，旨在为进一步探索Vpr治疗前列腺癌的作用及机制奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 腺病毒载体系统、菌种和主要试剂

　　腺病毒载体AdEasy系统包括骨架质粒pAdEasy1(氨苄西林抗性)为缺失E1区和E3区的5型野生型腺病毒基因组质粒。穿梭质粒pAdTrackCMV(卡那霉素抗性)带有GFP基因。大肠埃希菌BJ5183以及TOP10细胞购自Stratagene公司。真核表达质粒pCIneoVpr为本实验室先前构建[11]。

　　PC3细胞为雄激素非依赖性前列腺癌上皮细胞系，与腺病毒E1基因转化的人胚肾AD293细胞，均购自中科院上海细胞生物学研究所，分别生长于含10%灭活小牛血清(Invitrogen公司，美国)的RPMI 1640和DMEM培养基(Invitrogen公司，美国)中，37℃、5% CO2条件下培养。

　　试验中所用的各种工具酶、核酸标准分子质量参照物以及蛋白预染标准参照物均为美国Fermentas MBI公司产品。去内毒素质粒大量提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒分别为德国Qiagen公司和美国Omega 公司产品。质粒转染试剂LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司。鼠抗人α微管蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司。Flag M2单克隆抗体及用于蛋白质印迹检测的增强化学发光试剂ECL为美国Cell Signal公司产品。PCR引物由上海申能博彩生物有限公司合成。

　　1.2 重组腺病毒包装

　　1.2.1 Vpr基因片段的扩增 上游引物：5′AAA AGA TCT GCC ACC ATG GAA CAA GCC CCA3′(斜体部分为引入的Kozak序列;下划线部分为Bgl Ⅱ识别位点);下游引物：5′TTT TGC GGC CGC CTA CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC GCC TCC CGG ATC TAC TGG3′(斜体部分为引入Flag标签蛋白的编码序列以便于Vpr蛋白的表达检测，下划线部分为Not Ⅰ识别位点)。以pCIneoVpr质粒为模板，PCR扩增Vpr基因，产物大小约为341 bp。按文献所述构建PCR反应体系[12]：10×PCR 缓冲液 5 μl，dNTP 4 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 38 μl，DNA 0.5 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.5 μl，总体积50 μl。反应条件：94℃变性5 min，然后94℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min扩增30个循环，最后72℃延伸5 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后回收备用。

　　1.2.2 含Vpr基因片段的重组质粒pAdTrackVpr的构建及鉴定 分别用限制性内切酶Bgl Ⅱ、Not Ⅰ双酶切Vpr片段和穿梭质粒pAdTrackCMV, 酶切产物纯化后将线性化的载体与Vpr片段按1∶3的体积混合。45℃水浴5 min，冰浴3 min，加入T4 DNA连接酶及其缓冲液各1 μl，室温25℃条件下连接过夜。取适量连接产物转化大肠埃希菌TOP10感受态细胞，随机挑选卡那霉素抗性菌落少量制备得到质粒pAdTrackVpr，用Bgl Ⅱ和Not Ⅰ进行双酶切鉴定。

　　1.2.3 大肠埃希菌BJ5183中同源重组生成重组腺病毒质粒pAdEasyGFPVpr 取约50 ng pAdEasy1转化感受态BJ5183细胞，挑选氨苄西林抗性菌落，制备BJAdEasy感受态细胞。利用限制性内切酶Pme Ⅰ将重组质粒pAdTrackVpr进行线性化，取2 μl酶切产物转化BJAdEasy感受态细胞，挑选卡那霉素抗性菌落，快速少量制备质粒。经限制性内切酶Pac Ⅰ酶切鉴定和基因测序正确后将其命名为重组腺病毒质粒pAdEasyGFPVpr。

　　1.2.4 重组腺病毒AdEasyGFPVpr的包装和扩增 利用限制性内切酶Pac Ⅰ将重组腺病毒质粒pAdEasyGFPVpr线性化，回收并纯化大片段酶切产物。按照脂质体试剂说明书要求，将产物转染AD293细胞，并定期用荧光显微镜观察GFP表达。转染后7～10 d将细胞转入离心管中，500 r/min离心10 min，弃上清。细胞团块用pH 7.36的1×PBS重悬，反复冻融4次裂解细胞，短暂离心后收集病毒上清-70℃保存。取病毒上清的30%～50%感染汇合度为50%～70%的AD293细胞，荧光显微镜观察GFP表达。感染后3～5天同法收集重组腺病毒上清，可反复于AD293细胞中扩增病毒至所需滴度。另设未插入Vpr基因片段的重组腺病毒AdEasyGFP作为阴性对照。

　　1.2.5 重组腺病毒AdEasyGFPVpr的鉴定 取1 μl病毒上清，加入5 μl蛋白酶K，55℃反应1 h后水浴煮沸5 min。取1 μl所得产物进行PCR以扩增Vpr基因，引物及反应条件同前。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。同法处理空白对照腺病毒AdEasyGFP。

　　1.3 重组腺病毒滴度测定

　　接种AD293细胞于24孔板，按不同稀释倍数稀释病毒液并感染AD293细胞。继续培养24 h后于荧光显微镜下计数绿色荧光细胞。1个发光的细胞即为1个表达单位(expressionforming units，efu)，按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度(efu/ml)=(绿色荧光细胞数/视野)×(视野数/孔数)×病毒稀释倍数/病毒体积。

　　1.4 重组腺病毒感染PC3细胞

　　将重组腺病毒AdEasyGFPVpr病毒液分别以1、5、10的感染复数(multiplicity of infection，MOI)感染PC3细胞，48 h后在荧光显微镜下观察GFP表达情况。同时用空载体病毒AdEasyGFP感染PC3细胞作对照。

　　1.5 Vpr在PC3细胞中的转录和表达

　　于重组腺病毒感染后48 h收集PC3细胞，加入Trizol试剂裂解，按试剂说明书提取细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链。再以cDNA为模板，用上述设计的PCR引物及反应条件扩增Vpr基因，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时提取总蛋白，按文献[13]所述进行蛋白质印迹检测Vpr的蛋白表达情况。以空载体腺病毒AdEasyGFP感染的PC3细胞总蛋白作为对照。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增Vpr基因

　　PCR扩增出目的片段Vpr基因，全长约341 bp(图1a)，与预期片段大小一致。

　　2.2 含Vpr基因片段的重组质粒pAdTrackVpr的酶切鉴定

　　利用限制性内切酶Bgl Ⅱ、Not Ⅰ双酶切重组质粒pAdTrackVpr，产生大小约为9 300 bp和341 bp的两个片段(图1b)，分别代表载体pAdTrackCMV和Vpr基因。

　　2.3 重组腺病毒质粒pAdEasyGFPVpr的构建

　　利用Pme Ⅰ将重组质粒pAdTrackVpr线性化(图2a)，然后转化BJAdEasy感受态细菌(转化有骨架质粒pAdEasy的BJ5183细菌)。挑取克隆进行菌液PCR，同时提取质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定。经上述引物扩增后出现大小约为341 bp的Vpr目的片段(图2b)，用Pac Ⅰ酶切后产生3000 bp和4500 bp两种特征性大小的条带(图2c)。该质粒经核酸序列测定后Blast比对显示，克隆的基因序列和基因库中已登记的Vpr基因序列完全一致，引入的Flag序列正确，说明重组腺病毒质粒pAdEasyGFPVpr构建成功。

　　2.4 重组腺病毒AdEasyGFPVpr的包装和扩增

　　重组腺病毒质粒pAdEasyGFPVpr经Pac Ⅰ 酶切回收大片段后，采用LipofectamineTM 2000转染试剂，按照试剂盒说明书转染AD293细胞。同时以AdEasyGFP空载体转染细胞作为阴性对照。利用荧光显微镜可以观察到细胞于转染后4 d开始表达GFP(图3a)，转染7天后GFP表达明显增加(图3b)。此时收集细胞，反复冻融裂解细胞后收集病毒上清，即为一代病毒。用一代病毒上清感染AD293细胞进行扩增得到二代病毒，如此反复感染AD293细胞得到高滴度重组腺病毒。将带有目的片段Vpr的重组腺病毒定名为AdVpr，空载体病毒定名为AdVec。1～4代病毒分别感染AD293细胞2天后GFP表达情况见图3c-f。

　　2.5 重组腺病毒AdEasyGFPVpr的鉴定

　　取1 μl经蛋白酶K处理后的腺病毒AdEasyGFPVpr上清作为模板进行PCR，可扩增出大小约341 bp的片段，作为阴性对照的腺病毒AdEasyGFP上清无此片段(图4)。

　　2.6 重组腺病毒AdEasyGFPVpr滴度测定

　　经荧光计数法测得重组腺病毒的滴度为3 ×

　　a： 转染后4 d;b： 转染后7 d;c～f：1～4代病毒分别感染后2 d

　　图3 重组腺病毒AdEasyGFPVpr的包装和扩增

　　Fig 3 Generation of recombinant adenoviruses in AD293 cells

　　1：标准参照物;2：AdVpr;3：AdVec

　　图4 重组腺病毒感染AD293细胞培养上清PCR

　　Fig 4 PCR analysis of viral supernatant

　　108 efu/ml，空载体腺病毒AdEasyGFP的滴度为2.5 ×108 efu/ml。

　　2.7 Vpr基因在PC3细胞中的表达

　　重组腺病毒感染PC3细胞24 h后可观察到GFP表达，48 h后80%以上的PC3细胞表达GFP(图5a)，此时提取RNA进行RTPCR得到目的片段Vpr，而对照组细胞中无此条带(图5b)，表明Vpr在PC3细胞中得到了转录。同时提取感染48 h后的PC3细胞总蛋白进行蛋白质印迹检测，在约15 000处有一特异性条带(图5c)，与预期的蛋白大小一致，且蛋白浓度随着MOI的增高而增高，进一步表明Vpr蛋白能够在PC3细胞中获得表达。

　　a： AdVpr (MOI=5) 感染PC3，48 h后的荧光表达;b： AdVpr 感染PC3，RTPCR检测目的基因表达，1-3：AdVpr (MOI=1,5,10);4：AdVec;5：标准参照物;c： AdVpr 感染PC3，48 h后蛋白质印迹检测Vpr在PC3细胞中的表达

　　3 讨 论

　　前列腺癌的发病机制和治疗手段一直是人们探索的热点。鉴于目前常见治疗方法的各种局限性，人们对全新治疗方法和药物的探索一直没有停歇。近年来，有学者考虑，可利用某些病毒的特异性基因产物作为肿瘤治疗的新手段[2]，如HIV1编码的Vpr蛋白等。Vpr是HIV1的一个辅助蛋白，在病毒致病中起着重要作用[4]。Vpr蛋白有许多种功能，它可以将细胞停滞于G2/M期，同时也可以诱导细胞产生凋亡[5,6] ，这些特点也使得Vpr有希望应用在抗肿瘤治疗上。

　　研究显示，Vpr可以直接抑制体外的磷酸化酶Cdc25C的活性，从而阻断细胞周期蛋白B1p34Cdc2的激活，使得细胞周期停滞[14]。同时，Vpr通过结合到渗透性转变孔复合物(permeability transition pore complex，PTPC)使线粒体膜通透性增加，引起诸如细胞色素C等一系列分子从线粒体释放[15,16] ，释放的细胞色素C分子结合到Apaf1(凋亡肽酶激活因子1)上，进而形成凋亡复合物并被caspase 9激活而发生凋亡[8,17]。

　　Stewart等[7]的研究表明，Vpr体外可以诱导包括Hela细胞在内的多种肿瘤细胞系进入凋亡，并且这种诱导主要作用于快分裂细胞。同样的结果在宫颈癌细胞系[18]、口腔癌细胞系[19]及体外实验[2]中得以证实，且表明Vpr的抗肿瘤作用不依赖于p53的表达水平[9]，对正常细胞无明显的细胞毒作用[10]。

　　早期研究Vpr抗肿瘤作用多采用直接转染Vpr过表达质粒的方法[2]，虽然有一定效果，但表达效率低、不稳定。近年来开始采用慢病毒和腺病毒表达载体[7,19]，尤其是腺病毒载体，可以体外直接感染动物模型，受到研究者们的广泛认可。

　　应用Vpr表达载体于前列腺癌干预的研究报道仍较少。Muthumani等[3]在研究Vpr通过蛋白转导域(protein transduction domains，PTDs)作用于肿瘤细胞时应用到了前列腺癌细胞株LnCap。结果提示，Vpr可能有促进前列腺癌细胞系凋亡的作用，但其具体机制尚有待进一步的探索[3]。本文已利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了含HIV1 Vpr基因的重组腺病毒，使之有效感染前列腺癌细胞系PC3并在其中表达Vpr蛋白，为进一步探索Vpr在抗前列腺肿瘤方面的应用及相关机制奠定了基础。

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