放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

　　作者：龚明玉 张力 邵雪斋 作者单位：(承德医学院生物化学教研室，河北 承德 067000)

　　【摘要】 目的 探讨放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法 采用6MVX射线照射细胞，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNALADDER的形成，Western印迹方法检测细胞凋亡蛋白Caspase3的表达。结果 照射后48 h，2、4、6 Gy剂量组出现明显DNA降解(梯形结构)，但对照组及8、10 Gy剂量组无“梯形结构出现”。Western印迹方法分析发现照射后48 h，2、4、6 Gy剂量组HepG2细胞Caspase3蛋白表达明显增高,与假照射对照组(0 Gy)比较,差异具有显著性(P<0.05,P<0.01)。结论 X射线能在体外诱导HepG2细胞凋亡，其机制可能是通过激活Caspase3蛋白表达实现的。

　　【关键词】 细胞凋亡;X射线;Caspase3 基因表达

　　关于肿瘤发生的最新理论认为，正常细胞凋亡出现反常调控，凋亡过程受到抑制时，可引起细胞增殖，导致肿瘤发生〔1〕。国内外许多研究表明，电离辐射具有诱导细胞凋亡的作用。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinal aspartate specific protease，Caspases)已发现有14种，其中Caspase3为重要的细胞凋亡诱导因子〔2〕。关于放疗是否可诱导肝癌细胞株HepG2凋亡及具体机制尚不清楚。本研究利用人肝癌细胞株HepG2通过X线照射后Caspase3蛋白表达变化来观察放疗对细胞凋亡的影响，并对电离辐射诱导细胞凋亡的分子机制进行探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞与培养 人肝癌细胞株HepG2为单层贴壁生长(购自南京凯基生物科技有限公司)。培养液为RPMI1640培养基(GIBCO 公司产品)，内含10%新生牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素。将HepG2细胞置于37℃，5%CO2培养箱内培养至指数生长期进行实验，隔2-3 d传代一次，细胞消化液为0.25%的胰酶。

　　1.2 照射条件 应用6MVX线，源皮距100 cm，剂量率350 cGy/min，照射野面积10 cm×10 cm，培养皿上下各加1.5 cm的蜡膜。照射剂量分别为0、2、4、6、8、10 Gy。分别于照射后48 h进行标本处理。

　　1.3 DNA梯度测定 收集照射后的HepG2细胞(约2×107)，加入5×TBE缓冲液20 μl，10%SDS 5 μl，10 μg/ml 的RNA酶0.5 μl，去离子水74 μl，吹打混匀37℃水浴30 min。再加10 μg/ml的蛋白酶K 0.5 μl，37℃水浴30 min。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀后冰浴10 min，4℃离心10 min(12 000 r/min),取上清液加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠及2倍体积的无水乙醇混匀，混合后于-20℃静置30 min，此时可见DNA沉淀。4℃离心10 min(12 000 r/min),离心后弃上清液，以70%乙醇(1 ml)洗涤1次，4℃离心10 min(12 000 r/min),离心后弃上清液，室温晾干，再加入20 μl TE缓冲液，溶解DNA。在1.8%琼脂糖凝胶中进行电泳，60 V电压走60 min，在透射紫外灯下观察并拍照。

　　1.4 Western印迹检测Caspase3蛋白表达 收集2×106个细胞，用预冷的PBS洗2次，在4℃裂解30 min，用BCA100 Protein Quantitative Analysis Kit(上海申能博彩生物科技有限公司) 进行蛋白质定量，用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每泳道蛋白上样量为50 μg，湿转法把聚丙烯酰胺凝胶电泳中的蛋白质转到PVDF膜上，将PVDF膜浸入5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1 h，将膜分别加入1∶400 Caspase3(北京中杉生物科技有限公司)单抗稀释液4℃孵育过夜后，放入TBST配制HRP标记的二抗室温1 h，DAB显色。每组重复实验4次，采用TRANSILLUMINATOR 2020D成像系统(北京天能公司)，GerproAnalyier 4.0软件分别测每个条带灰度值，取其平均值。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，实验数据用x±s表示，计量资料多组间比较用方差分析，两两比较用q检验。

　　2 结果

　　2.1 琼脂糖凝胶电泳结果 不同剂量X线照射后提取的HepG2细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示，2、4、6 Gy组在照射后48 h出现DNA降解(梯形结构)，但对照组及8、10 Gy无“梯形结构”出现，提示X射线照射HepG2细胞，可诱使其产生凋亡。见图1。

　　2.2 Western印迹检测Caspase3蛋白表达情况 当不同剂量X射线照射后HepG2细胞Caspase3蛋白表达结果显示，2-8 Gy X射线照射后48 h，HepG2细胞Caspase3蛋白表达明显增高(分别为423.48±9.09，656.01±15.36，430.65±12.73，404.64±18.42，285.91±10.31)，其中2、4、6 Gy剂量组Caspase3蛋白表达与假照射对照组(0 Gy)(390.53±21.73)比较，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01)，见图2。

　　图1 琼脂糖凝胶电脉结果(略)

　　图2 Western印迹分析显示不同剂量射线照射后48 h Caspase3蛋白表达(略)

　　3 讨论

　　放射治疗是目前有效并被广泛采用的肿瘤临床治疗方法之一，电离辐射作为一种基因毒剂,可导致DNA 的严重损伤。细胞通过其非常精密的调控机制对此作出反应,通常为细胞修复、细胞周期阻滞或细胞凋亡,而细胞凋亡是电离辐射所致细胞死亡的主要形式〔3〕。细胞凋亡的显著生化特征是DNA降解为大约由180-200 bp 组成的寡核苷酸片段，目前常用DNA琼脂糖凝胶电泳检测其特有的“梯形结构”〔4〕，本实验采用此法对HepG2细胞进行的体外观察发现，2、4、6 Gy组在照射后48 h出现DNA降解，但对照组及8 Gy和10 Gy无“梯形结构”出现。提示6MVX射线照射HepG2细胞，可诱使其产生凋亡。

　　电离辐射对Caspases表达的影响及其生物学意义的研究近年来备受关注。Urashima等〔5〕报道5 GyX射线照射，可诱导MKN4及MKN28胃癌细胞凋亡，同时Caspase3表达明显增高。Enns等〔6〕报道5 Gy γ射线照射可诱导A549人肺癌细胞、T98G人胶质瘤细胞凋亡，其机制可能是由于Caspase3的激活所致。 Caspases是一类位点特异性的蛋白水解酶，是细胞凋亡信号的传导者及细胞凋亡的执行者。Caspase3无论在线粒体途径或是死亡受体途径所致的细胞凋亡中都是必需的。Caspase3能水解半胱天冬氨酰酶激活的核酸酶抑制剂ICAD，释放CAD进入细胞核，发挥脱氧核糖核酸酶活性降解染色体DNA，导致细胞凋亡〔7，8〕。综上所述，放疗可能是通过激活HepG2细胞内Caspase3而诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤的作用。

　　【参考文献】

　　1 Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease〔J〕. Science,1995;267(5203):14562.

　　2 Gashegu J，Vanmuylder N，Kassengera Z，et al.Expression of caspase3 and P53 during physiological apoptosis and apoptosis induced by three teratologic agents during early craniofaical development of the mouse embryo〔J〕.Morphologie，2005;89(258)：829.

　　3 Takahashi A，Kondo N，Inaba H，et al.Radiationinduced apoptosis in scid mice spleen after low dose irradiation〔J〕.Adv Space Res，2003;31(6):156973.

　　4 Dewey WC,Ling CC,Meyn RE.Radiationinduced apoptosis:Relevance to radiotherapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol phys,1995;33(4):78196.

　　5 Urashima T，Wang K，Adelstein SJ，et al.Activation of diverse pathways to apoptosis by (125) IdUrd and gammaphoton exposure〔J〕.Int J Radiat Biol ，2004;80(1112)：86774.

　　6 Enns L，Bogen KT，Wizniak J，et al.Lowdose radiation hypersensitivity is associated with P53dependent apoptosis〔J〕.Mol Cancer Res ，2004;2(10)：55766.

　　7 Enari M，Sakahira H，Yokoyama H，et al.A caspaseactivated Dnase that degrades DNA during apoptosis，and its inhibitor ICAD〔J〕.Nature ，1998;391(6662)：4350.

　　8 Wolf BB，Schuler M，Echeverri F,et al.Caspase3 is the primary activator of apoptotic DNA fragmentation via DNA fragmentation factor 45/inhibitor of caspaseactivated DNase inactivation〔J〕.J Biol Chem,1999;274：306516.