Prx1高表达对人PC3前列腺癌细胞氧化损伤的作用

　　作者：　沈传陆，朱俊 (东南大学基础医学院病理学与病理生理学系，江苏南京 210009)

　　Application of multidrug resistance of bladder tumor cell in the treatment of invasive bladder tumor

　　WU Xiao-peng，LU Shu-yan，CAI Lei-ming，ZOU Jian-gang，ZHOU Zhong-xing， GUAN Nai-fu，CHEN Yang-zhi，CHEN Jing

　　(Department of Urology，the Second Hospital of Changzhou，Nanjing Medical University，Changzhou213003，China)

　　Abstract:Objective To detect multidrug resistance in bladder tumor，thus to select sensitive drugs to treat invasive bladder tumor.Method In10cases of bladder tumors，P-gp，GST-p and TopoⅡwere detected by immunohistochemistry technique before intra-arterial chemotherapy.Results Before intra-arterial chemotherapy the expression rate of P-gp was30%，GST-p was10%，TopoⅡwas50%.Chemotherapy drug were THP，DDP and HCPT.After intra-arterial chemothera-py，the expression rate of P-gp was50%，GST-p was20%，TopoⅡwas40%，respectively.Conclusion Detection of P-gp，GST-p and TopoⅡplay a role in selection of drug in invasive bladder tumor.

　　Key words:bladder tumor;multidrug resistance;immunohistochemistry;chemotherapy

　　[摘要]目的: 探讨过氧化物还原酶1(Prx1)表达增加对人肿瘤细胞抗过氧化氢毒性作用的影响。 方法: 构建Prx1真核表达质粒，稳定转染培养的人PC3前列腺癌细胞，用Western blot检测Prx1在稳定转染PC3细胞中的表达，用MTT法观察细胞的存活率。 结果: Western blot分析表明，Prx1真核表达质粒稳定转染的PC3细胞表达Prx1显著增加;MTT分析表明，在过氧化氢浓度为0.25、0.5、1和2mmol?L-1 时，Prx1稳定转染的PC3细胞存活率显著增加。 结论: Prx1高表达显著增强人PC3前列腺癌细胞抗过氧化氢毒性作用。

　　[关键词] 过氧化物还原酶1;前列腺癌细胞;过氧化氢;稳定转染

　　在正常细胞代谢和对外部刺激的反应过程中，细胞可产生活性氧，包括氧自由基和过氧化氢(H2 O2 )等等。低浓度活性氧可促进多种细胞生长、增殖[1] ;相反，活性氧异常增加导致细胞损伤、死亡[2，3] 。为了对抗高浓度活性氧的毒性作用，经过漫长的生物进化，需氧生物特别是人类细胞都有一整套抗氧化防御机制，包括过氧化氢酶(catalase，Cat)、超氧化物歧化酶(su-peroxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，Glu)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、硫代还原物(thioredoxin，Trx)、硫代还原物还原酶(thioredoxin reductase，TR)和过氧化物还原酶(peroxiredoxin，Prx)

　　[4] 等等。

　　Prx是一类新定义的抗氧化物，在生物进化中高度保守，从低等原核生物细菌到高等生物人类，均有Prx表达。迄今，这个家族已有数百个成员。在人类组织细胞中发现了6种Prx

　　[5] ，其中，Prx1、Prx2、Prx3和Prx4含有两个保守的以半胱氨酸为中心的活性区域，称为2.Cys Prx;而Prx5羧基端半胱氨酸不在保守区域，称为非典型的2.Cys Prx;Prx6缺乏羧基端半胱氨酸，称为1.Cys Prx。在这些Prx中，Prx1、2和6位于细胞浆内，Prx3特异性位于线粒体内，Prx4为分泌型，Prx5既位于过氧化物酶体，又位于线粒体内。已有资料表明，许多Prx能够降低H2 O2 和其他过氧化物对细胞的损害。Prx1转染能提高人内皮细胞抗H2 O2 毒性作用[6] ;Prx1或Prx2转染能降低H2 O2 诱导的大鼠甲状腺细胞FRTL.5的凋亡[7] 。与相应的周围组织比较，胰腺癌[8] 和间皮瘤[9] 组织表达Prx1增多;乳腺癌[10] 、肝细胞癌[11] 和间皮瘤[9] 组织表达Prx3增多。本研究将观察Prx1稳定高表达是否影响人PC3前列腺癌细胞对H2 O2 的敏感性。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　限制性内切酶购自NEB公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)和抗微管蛋白抗体购自Sigma公司。抗Prx1多克隆抗体和pT7Prx1质粒参见文献[5]。

　　1.2 质粒构建

　　用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ酶切pT7Prx1生成人Prx1cDNA完整开放读码框架(open reading frame，ORF)，与经同样酶切的真核表达载体pcDNA3连接，生成质粒pcDNA.Prx1。

　　1.3 细胞培养

　　人PC3前列腺癌细胞(美国ATCC公司)被置于含10%胎牛血清、2mmol?L-1 谷氨酰胺、100kU?L-1 青霉素和100mg?L-1 链霉素的DMEM完全培养基中，37℃、体积分数为0.05的CO2 培养箱中培养。待细胞于2～3d基本融合，用0.125%胰蛋白酶.0.5%EDTA混合液消化，按1∶3～1∶4传代培养。

　　1.4 稳定转染

　　PC3细胞接种在培养皿中于体积分数为0.05的CO2 中37℃培养16～20h后，以pcDNA3空载体为阴性对照，用lipofectamineTM 2000(Invitrogen)将pcDNA.Prx1转染细胞24h。然后1∶10传代，并用400mg?L-1 G418筛选稳定转染细胞。

　　1.5 Western blot分析

　　用冰冷PBS溶液洗上述稳定转染PC3细胞2遍后，加入RIPA细胞裂解液。收集细胞裂解物，置冰浴孵育10min，然后4℃、14000r?min-1 离心10min，取上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜。分别用抗Prx1抗体和抗微管蛋白抗体及相应的HRP标记的二抗(Amersham)检测Prx1和微管蛋白(作为对照)，然后与增强型化学发光底物(Amersham)反应1min。将膜用保鲜膜包好，置暗盒中。在暗室内压上X光片，曝光适当的时间。取出X光片，进行适当的显影和定影，以显示各蛋白条带。

　　1.6 MTT分析

　　以每孔4×103 密度接种pcDNA3载体或pcDNA3.Prx1稳定转染的PC3细胞于96孔培养板各孔中，于37℃、体积分数为0.05的CO2 培养箱中培养24h。以未加H2 O2 的完全培养基为对照，用含0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2和4mmol?L-1 H2 O2 的完全培养基分别处理细胞24h后，每孔加入10μl MTT.PBS(5g?L-1 )。4h后加入100μl异丙醇.0.05μmol?L-1 盐酸，测定各孔OD570 的值，计算各孔细胞存活率。

　　1.7 统计学处理

　　数据以ˉx±s表示，并用ANOVA和Kruskal-Wallis分析进行显著性差异检验。

　　2 结 果

　　2.1 正义Prx1真核表达质粒的构建与鉴定

　　用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ酶切pT7Prx1生成人Prx1cDNA完整开放读码框架，与经同样酶切的真核表达载体pcDNA3连接，生成质粒pcDNA.Prx1。该质粒经SspⅠ酶切时出现1671kb特征性片段(结果未显示);经BamHⅠ加XbaⅠ双酶切时出现799bp长的Prx1插入片段(结果未显示)。DNA序列测定证实序列无误(图1)。

　　2.2 稳定转染人PC3前列腺癌细胞Prx1的高表达

　　用Prx1真核表达质粒pcDNA.Prx1和空载体pcD-NA3分别转染人PC3前列腺癌细胞后，经用G418筛选得到稳定转染细胞。与未转染的人PC3前列腺癌细胞和空载体转染细胞相比，pcDNA.Prx1稳定转染细胞表达Prx1蛋白显著增加(图2)。

　　2.3 高表达Prx1对人PC3前列腺癌细胞抗H2 O2 毒性作用的影响以未转染人PC3细胞为对照，在观察了空载体转染并不影响PC3细胞对H2 O2 的敏感性后(结果未显示，参见文献[5])，用不同浓度H2 O2 分别处理空载体和Prx1稳定转染的人PC3前列腺癌细胞24h，用MTT分析观察细胞的存活率，结果表明，在H2 O2 浓度为62.5μmol?L-1 和125μmol?L-1 时，两种稳定转染细胞的存活率仅轻微下降，两者之间无明显差异;在浓度为0.25mmol?L

　　-1 和0.5mmol?L-1 时，Prx1稳定转染PC3细胞存活率仍然仅轻度下降，而空载体稳定转染PC3细胞存活率显著下降。在浓度为1和2mmol?L-1 时，虽然Prx1稳定转染PC3细胞存活率也明显下降，但是，空载体稳定转染PC3细胞存活率下降更显著，两者之间差异性有统计学意义。特别有意义的是，Prx1稳定高表达使H2 O2 对人PC3前列腺癌细胞的半数致死量(LD50 )显著增加(图3)。

　　3 讨 论

　　本研究构建了人Prx1真核表达质粒，并用该质粒转染了人PC3前列腺癌细胞。经用G418筛选后，稳定转染的PC3细胞高表达Prx1。在用H2 O2 处理时发现，Prx1稳定高表达显著增强人PC3前列腺癌细胞抗H2 O2 毒性作用。 不同浓度的活性氧对细胞的影响不同。低浓度的活性氧刺激细胞生长、增殖[1] ，而中等浓度的活性氧诱导细胞凋亡，高浓度的活性氧促使细胞坏死[2，3] 。增多的H2 O2 既可直接进入细胞核内生成? OH损伤DNA，又可促进线粒体内细胞色素C[12] 和凋亡诱导因子[3] 释放，还可调节p53活性[13] 和Bax蛋白表达[7] ，导致细胞凋亡甚至坏死。在本研究中，由于使用了不同浓度的H2 O2 处理人PC3细胞，因此，作者认为细胞凋亡和坏死可能并存，需要进行专门的细胞凋亡分析，以明确H2 O2 对PC3细胞凋亡和坏死的影响。

　　Prx1属于2.Cys Prx，在H2 O2 作用下，其氨基端第51位半胱氨酸(Cys51 .SH)被选择性地氧化为Cys51 .SOH，同时，H2 O2 被还原为水而被清除。Cys51 .SOH与另一Prx1分子羧基端Cys172 .SH反应，生成分子间二硫键。在Trx系统(包括Trx、Trx还原酶和NADPH)作用下，Prx1被重新还原[14] 。因此，稳定高表达的Prx1可通过清除细胞内过多的H

　　2 O2 ，降低细胞内Bax蛋白的表达[7] ，从而抑制细胞凋亡及坏死。然而，在Trx系统功能障碍时，Cys51 .SOH也可被H2 O2 进一步氧化为Cys51 .SO2 H而使Prx1灭活15，16] 。所以，在高浓度H2 O2 作用下，Prx1高表达的PC3细胞存活率也明显下降，但仍然显著高于对照组。

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