维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

　　作者：曹娟，郑杰，吕秀宁 (东南大学基础医学院病理学与病理生理学系，江苏南京 210009)

　　[摘要]目的: 探讨维生素C是否能影响三氧化二砷(As 2 O3 )诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，以及它对细胞内端粒酶活性的影响。 方法: 用噻唑蓝(MTT)法筛选出维生素C的最佳浓度250μmol?L -1 ，并用该浓度联合不同浓度的As2 O3 同时处理HeLa细胞后，用光镜、MTT法和流式细胞术研究细胞生长和凋亡的情况，用TRAP.ELISA法检测细胞内端粒酶活性的变化。 结果: 单独1μmol?L -1 As2 O3 处理过的细胞生长未受到明显抑制，但联合250μmol?L-1 维生素C处理细胞，则细胞生长受到抑制，且部分细胞出现凋亡形态学特征。2、5、10μmol?L-1 As2 O3 联合维生素C用药组的细胞凋亡率也比单独用As 2 O 3 组明显增高，且出现凋亡的时间提早。端粒酶活性检测结果提示，联合用药组细胞内端粒酶活性均明显比单独用As2 O3 组低。 结论: 小剂量维生素C能增强As2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，并能增强As2 O3 对细胞内端粒酶活性的抑制作用。

　　[关键词] 维生素C;三氧化二砷;HeLa细胞;细胞凋亡;端粒酶

　　维生素C是自然界广泛存在的一种抗氧化剂，但近来研究表明维生素C不仅有抗氧化作用而且表现出一定的亲氧化作用[1] 。三氧化二砷(As 2 O3 )是中药砒霜的主要成分，具有一定的抗肿瘤作用。最近有研究显示维生素C可增强As 2 O3 诱导白血病细胞凋亡的作用[2～4] ，这种增强作用被认为可能与降低细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)水平和提高细胞内活性氧类(re-active oxygen species，ROS)水平有关[3，4] ，但具体机制不十分明确。本研究小组前期的工作显示As2 O3 能诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，这一作用可能与其抑制端粒酶活性有关[5] 。本研究旨在进一步研究维生素C对As2 O3 诱导HeLa细胞凋亡的影响，以及维生素C联合As2 O3 对宫颈癌HeLa细胞内端粒酶活性的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂As2 O3 (Sigma)用1mmol?L-1 NaOH将其完全溶解，调pH至7.2，用灭菌双蒸水配制成10mmol?L-1 溶液，4℃贮存，使用时用RPMI1640培养液稀释为工作浓度。噻唑蓝(MTT)和HEPES购自Amresco公司，RPMI1640培养基(粉剂)购自Gibco公司，维生素C购自Sig- ma公司，小牛血清购自杭州四季青公司，TRAP.ELISA试剂盒来自Roche公司，RT.PCR试剂盒来自Promega公司。

　　1.2 细胞培养及形态观察HeLa细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，用含10%小牛血清和100U?ml-1 青霉素、100U?ml -1 链霉素和HEPES的RPMI1640培养液，在37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养，每隔2～3d传代1次。实验选用对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化，用培养液稀释成单细胞悬液，以4000个细胞?孔-1 接种于96孔板中，16～24h用以下两种方法处理:一种单加不同浓度(1、2、5、10μmol?L -1 )As 2 O 3 ，另一种250μmol?L -1 维生素C加不同浓度(1、2、5、10μmol?L -1 )As2 O3 ，不加药组作为空白对照，每组6个平行孔，加药后每天用相差显微镜观察并记录用药组和对照组的细胞形态变化。

　　1.3 MTT检测

　　1.3.1 维生素C浓度的筛选 细胞准备方法同1.2。16～24h分别按以下分组加药:2μmol?L-1 As 2 O 3 组、2μmol?L-1 As2 O 3 加不同浓度(62.5、125、250、500、750、1000、2000、4000μmol?L -1 )维生素C组和对照组(未加药)，再在同样条件下培养48h后每孔加入20μl MTT(质量浓度为5g?L -1 ，用0.01mol?L -1 的PBS配制)后在同样条件下培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，在酶标仪(Multiskan MK3.353)上测定波长为492nm处的光吸收值(A)，每组设6个平行孔，取平均值，以(实验组A值.对照组A值)×100%计算细胞存活率。实验重复3次以上。

　　1.3.2 不同浓度As2 O3 联合维生素C对细胞生长的影响细胞准备方法和药物处理方法同1.2。药物处理细胞48h后作MTT检测(同1.3.1)，实验重复3次以上。

　　1.4 流式细胞术检测选用对数生长期HeLa细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种5×105 个细胞，16～24h用以下两种方法处理:一种单加As 2 O 3 (0、5μmol?L-1 )，另一种250μmol?L-1 维生素C加As2 O 3 (0、5μmol?L-1 )，在此条件下培养48h后消化液消化，Hank液终止消化收集细胞;PBS洗2次，1000r?min-1 离心5min，将70%冷乙醇缓慢滴入试管，并不停震荡试管，使细胞分散固定;PBS洗涤后弃上清，加入1%Triton-X.100，摇匀后静置10min，1500r?min-1 离心5min，弃上清;加入0.01%Rnase消化10min，1500r?min-1 离心5min，弃上清;加入0.005%的碘化丙锭染色15min，用300目丝网过滤后上机分析(FACS Vantage SE型，B.D公司生产)。每样本设立3管重复样本。

　　1.5 端粒酶活性检测端粒酶的活性检测按Roche公司提供的说明书操作。选用对数生长期HeLa细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种5×10 5 个细胞，培养16～24h加药处理(方法同1.2)。48h后收集细胞，用PBS洗两次，4℃3000r?min-1 离心5min;沉淀细胞中加入端粒酶提取液200μl，冰上孵育30min后4℃16000r?min-1 离心20min，取上清液(为确保无沉淀物误吸，一般只吸取150μl)置于另一Eppendorf管中，-70℃保存;取2μl上清液，再加入25μl TRAP.PCR扩增液(包括正义引物TS、反义引物CX、Taq聚合酶、dNTPs、镁离子等)，用DEPC水补充体积至50μl，瞬时离心后在PCR仪(PTC.100，MJ Research)上延伸和扩增;PCR扩增程序为:引物延伸(25℃30min)，端粒酶灭活(94℃5min)，扩增反应(变性94℃30s，复性50℃60s，延伸72℃30s，30个循环，72℃延伸10min)。取上述PCR产物5μl，加变 性液20μl，混匀，置室温10min，加入225μl杂交液(含地高辛标记探针)，混匀后取100μl加入抗生物素覆盖过的微孔板中，37℃混匀杂交2h;每孔加入100μl过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体(anti-DIG.POD)，室温下混合反应30min;每孔加入100μl POD酶的底物TMB(3，3′，5，5′-tetramethyl benzidine)，室温下混合反应15min后加100μl终止液终止反应，在酶标仪上测定450和690nm波长处的A值。A差值△A=A 450 -A 690 代表细胞内端粒酶活性。阳性对照为试剂盒提供的人胚肾293细胞株的端粒酶提取液，其PCR产物经ELISA检测，△A>1.5为阳性。阴性对照为HeLa细胞提取液，于65℃加热10min以灭活端粒酶，其PCR产物经ELISA检测，△A<0.2为阴性。

　　1.6 统计学处理 所有数值以ˉx±s表示，统计分析使用SPSS软件，数据使用t检验分析。流式细胞仪检测结果用百分数表示。

　　2 结果

　　2.1 As2 O3 联合维生素C对细胞凋亡的形态学影响HeLa细胞经As 2 O3 和维生素C处理(详见1.2)后，在相差显微镜下观察到单独1μmol?L-1 的As 2 O3 处理HeLa细胞48h，与对照组相比细胞生长无明显差异，但联合250μmol?L-1 维生素C后可见细胞生长明显受到抑制，细胞数减少。单独2μmol?L-1 的As 2 O 3 作用HeLa细胞24h后未见明显的凋亡形态特征，只有48h后才出现明显生长抑制和凋亡现象，但联合250μmol?L-1 维生素C组，24h即可见细胞变圆，细胞间距逐渐增大，出现部分细胞的凋亡形态学特征，细胞皱缩变圆。5、10μmol?L-1 As2 O 3 联合250μmol?L -1 维生素C处理的细胞上述变化都比单独As2 O 3 作用组明显(图1)。

　　2.2 As2 O3 联合维生素C对细胞存活率的影响

　　2.2.1 MTT法检测

　　2.2.1.1 不同浓度维生素C联合As 2 O3 对细胞的影响 用2μmol?L-1 As2 O3 联合不同浓度的维生素C同时处理HeLa细胞48h，结果显示2μmol?L-1 As2 O3 明显降低HeLa细胞的存活率，联合62.5μmol?L-1 维生素C与单独用As2 O3 组比较，细胞存活率即有下降;联合125μmol?L-1 维生素C与单独用As2 O3 组比较，细胞存活率下降更明显;联合250μmol?L-1 维生素C，细胞存活率较联合125μmol?L -1 维生素C时进一步下降;当A.对照组;B.1μmol?L-1 As2 O3 ;C.1μmol?L-1 As2 O 3 +250μmol?L-1 维生素C;D.2μmol?L -1 As2 O3 ;E.2μmol?L-1 As 2 O 3 +250μmol?L-1 维生素C图1 光镜下单独As2 O 3 或As 2 O3 加维生素C作用于HeLa细胞48h的形态学改变 ×100联合500μmol?L-1 维生素C细胞存活率下降就更明显，且随维生素C浓度的加大，细胞存活率下降越来越明显。但当维生素C浓度大至1000μmol?L-1 后，差异就不太显著了，P>0.05(图2A)。同时我们在检测单独不同浓度的维生素C对HeLa细胞的影响时发现，单独500μmol?L-1 维生素C也能诱导HeLa细胞凋亡(结果将另文发表)，而单独250μmol?L -1 维生素C却不能诱导HeLa细胞凋亡，因此我们选定250μmol?L-1 维生素C作为我们的联合用药浓度。

　　2.2.1.2 不同浓度As 2 O3 联合维生素C对细胞的影响 经不同浓度的As2 O3 单独处理HeLa细胞48h，以及其联合250μmol?L-1 维生素C处理HeLa细胞48h后进行MTT检测。我们发现，单独1μmol?L-1 的As2 O3 作用于HeLa细胞48h对细胞增殖影响不十分明显，但联合250μmol?L-1 维生素C作用后细胞存活率则明显降低;2、5、10μmol?L-1 的As2 O 3 联合250μmol?L-1 维生素C处理细胞的存活率均比单独As 2 O3 处理组低，且随着As 2 O3 浓度的加大差异越来越显著(图2B)。1.对照组(为100%);

　　2.2μmol?L-1 As2 O 3 组;3～10.分别对应2μmol?L-1 As2 O3 联合62.5、125、250、500、750、1000、2000、4000μmol?L -1 维生素C组 A.不同浓度维生素C联合2μmol?L-1 As 2 O3 对细胞 的影响B.不同浓度As2 O3 单独或联合250μmol?L-1 维生素C对细胞的影响(对照组为100%)图2 维生素C和As2 O3 对HeLa细胞生长的影响

　　2.2.2 流式细胞术检测HeLa细胞经As2 O3 和维生素C处理(详见1.4)48h后，作流式细胞分析发现对照组(0μmol?L-1 As2 O3 )、单独250μmol?L -1 维生素C处理组未出现DNA含量明显低于G1 期的亚G1 期的凋亡峰，而5μmol?L-1 的As 2 O3 、250μmol?L-1 维生素C加5μmol?L -1 的As2 O 3 处理组细胞出现明显的凋亡峰，且联合用药组细胞凋亡 率明显比单独用As2 O3 组的凋亡率高，分别为16.42% 和21.78%(图3)。A.对照组;B.250μmol?L -1 维生素C;C.5μmol?L-1 As2 O3 ;D.5μmol?L-1 As2 O3 +250μmol?L-1 维生素C 图3 As 2 O 3 联合维生素C作用于HeLa细胞48h流式细胞仪检测结果

　　2.3 As 2 O 3 联合维生素C对细胞内端粒酶活性的影响 单独用0、1、2、5、10μmol?L-1 As 2 O3 和用上述这些浓度的As 2 O3 联合250μmol?L-1 维生素C处理HeLa细胞48h后检测细胞内端粒酶的活性，表1结果显示1μmol?L-1 组端粒酶活性抑制不明显，但联合维生素C作用后，其端粒酶活性抑制明显增强;2、5、10μmol?L-1 As2 O3 组可明显抑制端粒酶活性，但这种抑制作用能被250μmol?L-1 维生素C增强，这种增强作用在统计学上有显著性差异(P<0.05)。可见端粒酶活性的变化在维生素C增强As 2 O3 诱导HeLa细胞凋亡途径中发挥非常重要的作用。

　　3 讨 论

　　维生素C是具有许多生物学功能的水溶性的葡萄糖类物质，是具有6个碳原子的酸性多羟基化合物，在一定条件下其分子中2位和3位碳原子的两个烯醇式羟基可解离释放出H+ ，使维生素C被氧化成脱氢维生素C。这种氧化型与还原型维生素C之间可相互转变，在生物组织中形成一个氧化还原体系。但在某 表1 维生素C联合As 2 O 3 对HeLa细胞端粒酶活性的影响(略)单独用对应浓度的As2 O3 组比较，P<0.05些条件下，特别是在过渡金属(如Cu 2+ 等)存在的情况下，维生素C还表现出一定的亲氧化作用，它能自身氧化产生H 2 O2[1] 。

　　Sestili等6] 认为高剂量维生素C有亲氧化作用，低剂量有抗氧化作用。维生素C的这种双重作用使它在肿瘤防治中发挥着非常重要的作用，它既能防止化疗药物对正常组织的损伤作用[7] ，又能协同化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡[8] 。近年来研究显示As2 O3 具有一定的抗肿瘤作用，本研究小组也已实验证明它能诱导肿瘤细胞凋亡[5，9] 。那维生素C能否增强As2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡呢?我们的实验结果显示低剂量维生素C(250μmol?L -1 )联合不同浓度As 2 O 3 处理HeLa细胞后其形态学、MTT结果和流式细胞术结果均证明比单独用As2 O 3 处理HeLa细胞后抑制细胞生长更明显，且形态学观察提示As 2 O3 联合维生素C作用细胞后，其生长抑制现象出现得更早，因此维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用是肯定的。这与国外报道维生素C增强As2 O3 诱导白血病细胞凋亡的结果[2～4] 是类似的。维生素C增强As 2 O3 诱导白血病细胞凋亡被认为是，由于维生素C起自身氧化产生H2 O2[4] 和降低细胞内GSH水平并提高细胞内H2 O2 从而促细胞凋亡的3，4] 。本研究小组未发表实验结果也显示维生素C增强As 2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞或许与上述途径有一定关系，我们正在对这一结果作进一步实验证实。

　　Reddy等[8] 认为维生素C能通过稳定P53表达和抑制人类乳头状病毒(human papilloma virus，HPV)E6表达，从而增强顺铂和依托泊苷(etoposide)诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用。Ku-mar等10] 发现维生素C能加剧H2 O2 诱导细胞凋亡，在试验中他们发现维生素C联合H2 O2 处理羊膜起源的WISH细胞后，细胞内的细胞色素C的释放增加，DNA损伤增加，核基质蛋白(nuclear matrix protein，NMP)释放也增加，可见维生素C的促凋亡作用在一些细胞株是存在的。

　　端粒酶是真核细胞染色体末端的核糖核蛋白复合体，人端粒酶由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白1(TP1)和端粒酶催化亚单位(hTERT)3部分组成。端粒酶的活性在体细胞受到严重抑制，但在80%左右的恶性肿瘤存在端粒酶活性的重新激活，因此抑制端粒酶活性便成为肿瘤治疗研究的新焦点。有学者研究As2 O3 对胃癌端粒酶活性的影响时发现，As2 O3 抑制胃癌端粒酶活性，并呈时间和剂量依赖性11] 。还有研究用2μmol?L-1 的As 2 O3 诱导HL.60细胞凋亡时发现hTERT mRNA显著下调，细胞内hTERT蛋白含量也相应降低，端粒酶活性明显受抑[12] 。端粒酶活性增强可能是肿瘤细胞不易凋亡的重要机制，研究表明，诱导人肿瘤细胞hTERT显性突变，降低内源性端粒酶活性，端粒酶持续缩短，肿瘤细胞最终发生凋亡[13] 。

　　Reddy 等8] 认为维生素C增强顺铂诱导HeLa细胞凋亡与端 粒酶的活性有着密切的关系。我们的实验结果显示2μmol?L1 以上As2 O3 处理细胞可明显抑制端粒酶活性，但这种抑制作用能被250μmol?L-1 维生素C显著增强(表1)，这与MTT和流式细胞检测的结果是相吻合的。MTT结果提示当250μmol?L -1 维生素C联合1μmol?L -1 As 2 O 3 处理细胞48h后，细胞的存活率明显低于单独用As 2 O3 组，且随着As2 O 3 浓度的增大该加强作用更显著(图2B)，这跟表1中端粒酶活性的改变是一致的。同样我们的流式检测结果也提示单独5μmol?L-1 As 2 O3 处理HeLa细胞48h后细胞的凋亡率为19.62%，联合250μmol?L-1 维生素C作用后其凋亡率提高到26.10%(图3)。表1中我们可看到，5μmol?L-1 As2 O3 联合250μmol?L-1 维生素C作用后，反映细胞内端粒酶活性的A值由1.233下降至0.879，可见维生素C增强As 2 O3 诱导HeLa细胞凋亡与端粒酶活性改变有关，但维生素C增强As2 O3 抑制端粒酶活性的机制尚不清楚，还需要作进一步深入研究。

　　因此，维生素C增强As 2 O3 诱导HeLa细胞凋亡及其与端粒酶活性改变的关系在本研究中得到了证实。从我们的研究结果可以看出，小剂量维生素C应用于临床宫颈癌乃至其他实体肿瘤化学治疗的可能性是存在的，该实验为维生素C的临床应用提供了一些理论依据。

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