c-jun氨基末端激酶在胃癌组织中的表达

　　作者：朱德淼 作者单位：辽宁医学院，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 研究c-jun氨基末端激酶(JNK)对胃癌细胞的促凋亡作用。方法 采用免疫组化S-P法检测62位患者的胃癌手术石蜡标本中JNK的亚组(jnk1,jnk2)及其下游表达产物c-jun的表达，并对结果进行统计学分析。结果 高分化胃癌中的jnk1,jnk2及c-jun含量显著高于低分化的胃癌组织并且与淋巴结转移密切相关，三者均与年龄、性别、肿块大小及PTNM分期无关。结论 JNK促进胃癌细胞的凋亡，抑制胃癌细胞的淋巴结转移。

　　【关键词】 c-jun氨基末端激酶(JNK 胃癌组织 免疫组化S-P法

　　Expression of JNK in Human Gastric Cancer Tissue

　　and the Meaning of It

　　ZHU De-miao，FU Xiao-guang

　　Liaoning Medical University Jinzhou 121001 China

　　【Abstract】 Objective This paper is to observe the expression of JNK in human gastric tissue and its role in promoting the apoposis of gastric cancer cells. Methods The expression of JNK in human gastric tissue was examined by immunohistochemistry of 62 gastric cancer specimen in paraffin to observe the expression of jnk1,jnk2 and c-jun and to analyze the consequence.Results Jnk1,jnk2 and c-jun have the negative relationship with pathoclass.The contents of them in well-differentiated gastric tissue were significant higher than in poorly-differentiated tissues and they had the relationship with nodus lymphaticus diversion,but they had no relationship with ages,gender,size of tumeur and PTNM. Conclusions JNK promotes the apoposis of the gastric cancer and prevent the nodus lymphaticus diversion.

　　【Key words】 JNK;gastric tissue;immunohistochemistry; S-P methods

　　作为细胞应激产物的c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase ,JNK) / 应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase , SAPK)信号传导系统，是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases ,MAPK)家族的一员。目前在哺乳动物已鉴定了4 个MAPK亚族: 细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinase , ERK) 、JNK) / SAPK 、ERK5/ 大丝裂原活化蛋白激酶1(big MAP kinase 1 ,BMK1) 和P38MAPK，许多研究表明MAPK家族与细胞凋亡密切相关，不同形式的刺激通过不同的信号途径介导JNK的活化，细胞因子如TNF,IL-1和许多环境应激如热休克、渗透压、还原剂、放射线等都能够激活JNK， 细胞凋亡和抗凋亡是一种统一的动态平衡关系。其间的各种信号转导途径和信号分子之间形成“跷跷板”(seesaw) ,调控着细胞的生存和死亡。研究表明，细胞凋亡失衡与肿瘤的发生有关。本文用免疫组化法对JNK在胃癌中的表达情况及其意义进行了研究，现报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 试验材料的选择

　　62例胃癌病理标本均取自锦州医学院附属第一医院病理科(2003年9月至2005年7月)手术切除原发性胃癌标本，所有标本术前均未进行化疗，并经病理确诊。其中男性30例，女性32例。年龄在35～78岁，平均年龄61岁。其中高/中/低胃癌分别为16/28/18例。淋巴结转移51例，未转移11例。按照PTNM分期Ⅰ期+Ⅱ期共计46例，Ⅲ期+Ⅳ期共计16例。

　　1.2 试验试剂、试验方法及结果判定

　　鼠抗人JNK1单克隆抗体(1∶50)、鼠抗人JNK2单克隆抗体(1∶50)和鼠抗人c-Jun单克隆抗体(1∶70)均购自晶美生物工程有限公司(系Santa Cruz Biotechnology产品)，SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，操作严格按试剂盒说明进行。DAB显色。采用SP法对全部标本进行免疫组化染色，染色前用微波炉进行抗原修复。用已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。

　　阳性判断标准以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，随机观察500个细胞，JNK途径各因子的染色结果分五级：阳性细胞数<1%为0级，1%～24%为1级，25%～49%为2级，50%～74%为3级，75%～100%为4级，设定0、1、2级为低表达，3级和4级为高表达。

　　1.3 统计学分析

　　朱德淼,等.c-jun氨基末端激酶在胃癌组织中的表达辽宁医学院学报 2007年2月，28(1)应用SSPS统计软件进行数据处理。采用χ2检验P进行分析,P﹤0.05具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫组化染色结果

　　jnk1在胃癌中的高表达为45.16%(28/62)，低表达为54.84%(34/62);Jnk2在胃癌中的高表达为46.77%(29/62)，低表达为53.23%(33/62);c-jun在胃癌中的高表达为41.94%(26/62)，低表达为58.16%(30/62)，见表1、表2、表3。表1 jnk-1的表达与临床病理特征的关系 (略)表2 jnk-2的表达与临床病理特征的关系 临床病理特征例数Jnk-2的表达 (略)表3 c-Jun的表达与临床病理特征的关系(略)

　　2.2 统计学分析结果

　　高中分化胃癌组织中的jnk1、jnk2、c-jun的含量显著高于低分化的胃癌组织，且三者均与淋巴结转移有关。三者均与年龄、性别、肿块大小、及PTNM分期无关，见表1、2、3。

　　3 讨 论

　　胃癌是临床上常见的恶性肿瘤，在我国每十万人口的年死亡率约为25.是最常见的恶性肿瘤，而且还有继续上升的趋势[1]。胃癌的早期症状多不明显，临床就诊的病人当中，经胃镜等辅助检查确诊的病人大多已属于中晚期，丧失了治疗的最佳时机。了解胃癌细胞的产生，发展及其抑制因素，可以有效的控制胃癌的发病率，并为临床诊断和早期治疗提供有效的途径。

　　作为细胞应激产物的c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase ,JNK) / 应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)信号传导系统，是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases ,MAPK)家族的一员。许多研究表明MAPK家族与细胞凋亡密切相关，不同形式的刺激通过不同的信号途径介导JNK的活化，细胞因子如TNF,IL-1和许多环境应激如热休克、渗透压、还原剂、放射线等都能够激活JNK，其可能转导并调控着细胞凋亡的信号，因此对MAPK家族的研究也越来越受到关注。JNK是MAPK家族中主要的通路之一，它位于细胞质，是分子量为54ku的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。JNK包含双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr, 与c-jun N端的活化区结合，使其第63，73位丝氨酸残基磷酸化[2]，JNK的活性是通过对其氨基酸残基进行磷酸化，一旦被激活，JNK便由细胞浆跑入细胞核。活化的JNK 既可以通过磷酸化p53 和Myc蛋白, 也可以通过磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL, 促进细胞色素c自线粒体释放, 从而诱导细胞凋亡。

　　JNK信号转导通路由应激反应引起的， JNK致凋亡作用首次在神经元细胞中被发现，细胞凋亡对神经元细胞发育具有显著作用，凋亡在障碍会使神经元变性退化过程发生紊乱，神经生长因子从PC-12嗜铬细胞瘤中取出后，引起了持续的JNK和P38酶的激活，及ERK的抑制，从而导致细胞凋亡。[3]神经酰氨和鞘氨醇可以抑制淋病细胞U937的增殖，引起DNA的降解及细胞调亡。神经酰氨通过刺激JNK途径引起细胞凋亡，而鞘氨醇是通过抑制ERK途径引起细胞凋亡[4]。上述研究表明，JNK在射线诱导的细胞凋亡中其重要作用，JNK的活化间期可能参与对细胞命运的调控。[5]

　　在机体的生命活动中, 细胞凋亡和抗凋亡是一种统一的动态平衡关系。其间的各种信号转导途径和信号分子之间形成“跷跷板”(seesaw) ,调控着细胞的生存和死亡。研究表明，细胞凋亡失衡与肿瘤的发生有关。近年来许多的证据表明，JNK在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。野生型小鼠经TPA诱导产生的乳头瘤平均数比jnk2-/-小鼠多，生长速度更快且更易形成血管，提示jnk2可能与肿瘤组织血管的形成有关。在野生型小鼠中TPA可诱导ERK的磷酸化和AP-1DNA结合活性，但在jnk2-/-却受到了抑制。提示JNK信号传导通路与肿瘤侵袭演进起重要作用[6]。通过jnk3-/-小鼠研究证实，jnk3信号途径介导中枢神经组织的凋亡。Jnk3的缺矢在人脑肿瘤的发生发展中起重要作用[7]。2002年Yan chen等研究发现在胃癌细胞中，JNK被TPA(12-o十四烷酰佛波醋酸酯-13)激活，并通过PKC途径，促进胃癌细胞的凋亡。2003年阙红艳等研究发现喉癌组织中c-jun蛋白的表达指数与喉癌与喉癌组织的病理分级、颈淋巴结转移密切相关，即c-jun的阳性指数越高，喉癌组织分化程度越高，颈淋巴结转移发生越少，这提示c-jun蛋白在某种程度上可以可以提高喉癌组织的分化程度和减少淋巴结的转移。郭连英等用榄香烯处理肝癌细胞，并用透视电镜观察，发现肝癌细胞的细胞周期阻滞在G1期以及S期与G2期交接处，从而得出榄香烯可能通过激活JNK，阻止细胞进入有丝分裂期[8]。蒋明德等用SP600125处理乙醛刺激的HSC后, JNK磷酸化水平降低明显低于乙醛组,而且呈剂量依赖关系; 同时其凋亡率比乙醛组明显增加,表明 乙醛能激活HSC中JNK通路,而且JNK活化程度越高,细胞凋亡率越低, JNK对HSC的凋亡具有保护作用;当用SP600125抑制了JNK通路的激活作用后,细胞凋亡率升高。进一步证实JNK的活化程度与凋亡呈负相关初步证实JNK活性变化与乙醛刺激的大鼠HSC的凋亡具有相关性,提示JNK可能是调节HSC凋亡的重要信号通路之一[9]。肖浩文等通过研究发现维生素E琥珀酸酯(VES)对人B细胞白血病细胞株(Raji)的作用得出VES通过增加Raji细胞JNK磷酸化反应，并持续激JNK,从而引起Raji细胞的凋亡[10]。

　　综上所述，本试验研究发现，JNK在高分化的胃癌组织中的含量要远远高于低分化的胃癌组织，其与淋巴结转移有关，其原因可能是当某种因素引起细胞发生变异或体内正常胃细胞逐渐凋亡时，JNK通过活化p53 和Myc蛋白, 也可以通过磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL, 促进细胞色素c自线粒体释放, 从而诱导细胞凋亡，同时也可以激活T细胞，以促进细胞的凋亡，以减少变异细胞的产生，从而抑制癌细胞的形成并在一定程度上杀灭癌细胞。当癌组织形成后JNK通过抑制胃癌细胞进入有丝分裂，阻止癌细胞增生，并且JNK能够抑制已经形成的胃癌组织的新生血管的形成，在一定程度上减弱了胃癌组织的繁殖能力，同时通过抑制淋巴结的转移，减弱癌细胞的转移速度，从而实现对癌细胞的形成、繁殖、扩散等各个过程的抑制作用。在肿瘤形成的早期和分化较高的癌组织中，体内的JNK的表达水平较高，同时体内的T细胞活性较强，此时肿瘤细胞极少运动，对肿瘤细胞有较强的杀伤作用使肿瘤细胞不易发生转移。但是肿瘤的中后期， 蛋白表达水平降低使其促进肿瘤细胞分化的作用减弱，以及细胞营养受限使细胞生长受到抑制，活化的T细胞减少，肿瘤细胞运动和浸润能力增强，突破基底膜，从而发生转移。但是，能否人为的增强JNK的活性，以提高JNK表达产物的数量从而在最大限度上抑制胃癌的发生，还有待于进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]吴在德.外科学[M].第5版.北京:人民卫生出版社,2001.530-532.

　　[2]钟显飞,蒋明德 . c-Jun氨基末端激酶信号转导通路在细胞凋亡中的作用 [ J ]. 第四军医大学学报 ， 2005， 26 (16)：1533-1536.

　　[3]Huang C Ma, WY,Dong Z， The extra cellular-signal regulatedprotein kinases (Erks) are required for UV-induced AP-1 activation in JB6 cells[J]. Oncogene，1999， 18: 2828-2831.

　　[4]Pearson G, Robinson F, Beers Gibson T, et al. Mitogenactivated protein (MAP) kinase pathways: Regulation and physiological functions[J]. Endocr， 2001， 22:153-157.

　　[5]Chen YR, Tan TH. The c-Jun N-terminal kinase pathway and apoptotic signaling ( review) [ J ]. Int J Oncol, 2000， 16 (4):651-654.

　　[6]She QB, Chen N, Bode AM, et al.Deficiency of c-Jun-NH2-terminal kinase-1 in mice enhances skin tumor development by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate[J]. Cancer Res， 2002，62:1343-1348.

　　[7]阙艳红.喉癌组织中c-jun蛋白的表达及其对细胞增殖和凋亡作用的研究[J]. Chinese Journal of Caner， 2003,22(5):500-504.

　　[8]郭连英.JNK/SAPK信号传导通路在榄香烯抗肝癌效应中的作用[J]. 中国肿瘤生物学杂志， 2005， 12(3):205-209.

　　[9]蒋明德.JNK信号通路在乙醛刺激的肝星状细胞凋亡中的作用[J].第四军医大学学报， 2005， 26 (10)：915-918.

　　[10]肖浩文. 氨基末端激酶信号通路在细胞凋亡中的作用[J]. 中国公共卫生，2005，01:13-17.