差别PCR技术检测卵巢癌c-erbB-2癌基因扩增的研究

　　作者：张竹强 岳秀兰 曹虹然 白雪峰 作者单位：包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014010;包头市第七医院

　　【摘要】 目的: 探讨卵巢癌c-erbB-2癌基因扩增的临床意义。方法: 应用差别PCR技术检测36例原发性卵巢癌c-erbB-2癌基因的扩增情况。 结果: (1)卵巢癌组织中c-erbB-2癌基因的扩增率为58.3%(21/36);(2)肿块≥5cm的卵巢癌组织及中晚期卵巢癌患者c-erbB-2癌基因扩增率分别为67.9%、73.9%，明显高于肿块<5cm的卵巢癌组织25.0%的扩增率和早期卵巢癌患者30.8%的扩增率，均有显著差异(P<0.05);(3)卵巢癌组织中c-erbB-2癌基因扩增与患者年龄、病理类型、淋巴转移、雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)无相关性。结论: c-erbB-2癌基因扩增与卵巢癌的发生有一定关系，c-erbB-2癌基因扩增对卵巢癌的治疗、预后判断具有重要的临床应用意义。

　　【关键词】 卵巢癌;c-erbB-2;差别PCR;癌基因扩增

　　卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,占女性生殖系统恶性肿瘤的20%，而且近年来发病率呈上升趋势。由于其恶性程度高、早期诊断困难，卵巢癌病死率居妇科恶性肿瘤之首，成为妇科恶性肿瘤中威胁最大的疾病。卵巢癌相关基因的深入研究和基因检测技术的发展对于判断卵巢癌的生物学行为、提高卵巢癌的早期诊断、判断预后及指导治疗具有重要意义。c-erbB-2(HER2/neu)癌基因，主要在胚胎发育时开始表达，成年后正常组织仅可检测到少量表达[1],其扩增或过度表达见于人类多种肿瘤，临床研究不断显示c-erbB-2的扩增或过度表达对人类卵巢癌细胞具有重要作用。近年来有关c-erbB-2过度表达与卵巢癌的关系研究较多，而对于c-erbB-2癌基因在卵巢癌中的扩增情况及其临床意义，国内研究较少，且结果报道不一，存在一定争议。本文应用差别PCR(differential PCR)技术检测36例卵巢癌中c-erbB-2癌基因的扩增情况，探讨c -erbB-2基因扩增在卵巢癌发生发展中的作用及其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 检测标本 36例卵巢癌新鲜组织标本取自2005年1月至2006年9月间在包头市第七医院、包钢医院及内蒙古医学院第一附属医院住院手术的患者，经病理确诊均为卵巢癌,其中浆液性囊腺癌12例，黏液性囊腺癌7例，子宫内膜样癌9例，恶性畸胎瘤3例，颗粒细胞癌5例;年龄28~75岁，平均46.5岁。按照FIGO国际妇产科联盟诊断标准，其中临床Ⅰ期0例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例，标本立即剔除血块及脂肪组织，置于-20℃冰箱中冷冻保存。取其中30例自身癌旁正常卵巢组织作对照。

　　1.2 试剂与仪器 试剂：DNA提取试剂盒由上海生工生物工程公司生产;TaqDNA polymerase、PCR reaction buffer、dNTPs、Marker均由北京鼎国生物技术发展中心生产;引物由上海生工生物工程公司生产;PCR仪(PE480)由The Perkin-Elmer Corporation生产;高速离心机TGL-16B由上海安亭科学仪器厂生产;紫外透射反射分析仪KH-UVⅢ型由上海康禾光电仪器有限公司生产。

　　1.3 方法

　　1.3.1 DNA提取 采用上海生工生物工程公司生产的SK1342临床样品基因组DNA抽提试剂盒提取组织中的DNA，作为PCR反应的模板。

　　1.3.2 引物设计和合成 用于差别PCR扩增的两对引物序列参照文献设计[2]，由上海生工生物工程公司合成。第一对引物用于特异性地扩增c-erbB-2基因序列第2 122～2 219位的98个碱基，引物序列如下：上游引物为5′-CCT CTG ACG TCC ATC ATC ATC TC-3′，下游引物为5′-ATC TTC TGC TGC TGC CGT CGC TT-3′。第二对引物用于特异性地扩增β-actin基因序列第 405～722位的318个碱基，引物序列如下：上游引物为5′-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3′，下游引物为5′-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3′。

　　1.3.3 差别PCR反应体系及条件 总反应体系25μL，内含DNA模板5μL,10mmol/L dNTP 0.8μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL，TaqDNA聚合酶2U，c-erbB-2及β-actin上下游引物终浓度0.33μM，用双蒸水补足反应体积，再加入无菌液体石蜡1滴，分别扩增正常组织和癌组织模板DNA。PCR循环参数：95℃预变性2min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸36s，共35个循环。最后72℃延伸5min。

　　1.3.4 PCR产物鉴定 在PCR反应液中加入1μL溴酚蓝载样液，取该PCR反应产物15μL及10μL Marker在含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳25min。参照Marker的区带位置判定PCR扩增产物，与Marker 100bp相对应的区带为c-erbB-2(98bp)，与300bp相对应的区带为β-actin(318bp)。

　　1.3.5 c-erbB-2原癌基因扩增的判定 电泳结果应用凝胶KH-UV Ⅲ型紫外透射反射分析仪扫描记录，凝胶分析软件(Media Cybernetica公司产品)测定c-erbB-2及β-actin区带光密度值(IOD值)。c-erbB-2基因相对拷贝数=c-erbB-2电泳区带光密度值/β-actin电泳区带光密度值，该比值×318/98为校正拷贝数。因β-actin扩增片段为318bp，而c-erbB-2扩增片段为98bp，c-erbB-2吸附的溴乙锭较少，光密度值较小，故需校正。计算癌旁正常组织校正拷贝数单侧99%参考值范围，癌组织校正拷贝数大于正常组织99%参考值范围上限者判定为扩增。

　　1.4 统计分析 应用SPSS11.0统计软件，采用卡方检验分析实验数据。

　　2 结果

　　2.1 c-erbB-2校正拷贝数正常值范围及扩增的判定标准 正常组织c-erbB-2/β-actin电泳区带光密度值校正拷贝数均值为1.00(0.59～1.52)，标准差为0.27。单侧99%参考值上限为1.63，如卵巢癌组织中c-erbB-2/β-actin校正拷贝数>1.63者即可判定为扩增。

　　2.2 癌组织中c-erbB-2原癌基因扩增情况 36例卵巢癌组织中21例见c-erbB-2原癌基因扩增，校正拷贝数0.93～3.01，扩增率58.3%(21/36)。电泳结果见图1。

　　图1 卵巢癌组织及癌旁正常组织中c-erbB-2癌基因差别PCR检测电泳结果(略)

　　N1～N4 癌旁正常卵巢组织，C1～C4卵巢癌组织标本，M：DNA Marker，其中C1、C3存在c-erbB-2基因扩增，C2、C4未扩增。

　　2.3 c-erbB-2原癌基因扩增与卵巢癌临床病理的关系 c-erbB-2原癌基因扩增与肿块大小、临床分期有显著相关性，肿块≥5cm、中晚期患者c-erbB-2癌基因扩增率显著高于肿块<5cm、早期患者，而与患者年龄、病理类型、淋巴结转移、雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)无显著相关性。详见表1。

　　3 讨论

　　c-erbB-2又称neu或HER-2基因，由Shih等首次从乙基亚硝脲诱导的大鼠神经胶质纤维瘤中分离得到，Padhy等进一步证实该癌基因与编码表皮生长因子受体(EGFR)的基因一样与病毒癌基因v-erbB-2具有同源序列，因此将其命名为c-erbB-2，属于EGFR家族成员，包括erbB-1、erbB-2、erbB-3和erbB-4[3]。c -erbB-2原癌基因定位于第17号染色体长臂q11.2-12位，编码185kD具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体，与EGFR具有惊人的结构相似性[4]。c-erbB-2在EGFR家族中发挥关键作用，它与其他表皮生长因子受体一起，通过复杂的信号网络调节细胞生长、分化[5-6]。

　　表1 c-erbB-2基因扩增与卵巢癌临床病理的关系(略)

　　现有的研究表明，人类肿瘤细胞中c-erbB-2基因的异常主要为基因扩增和过度表达，少数存在着c-erbB-2基因的突变和重排[7]。基因扩增与mRNA及蛋白产物的高表达存在一致的关系[8]。c-erbB-2通过基因扩增等途径激活，变为活化的癌基因，参与细胞生长调控，可促进细胞癌变和癌细胞生长增殖。迄今已发现在多种人类肿瘤中存在c-erbB-2基因的扩增及/或蛋白的过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、肺癌及前列腺癌等[9]，表明它在肿瘤的发生、发展、转移及预后等方面发挥着作用[10]。本实验中我们应用差别PCR检测了36例原发性卵巢癌组织中c-erbB-2的扩增情况，扩增率为58.3%(21/36)，明显高于正常卵巢组织，且扩增多发生在Ⅲ期及Ⅳ期卵巢癌组织中，与Hogdall等[11]应用同种方法检测181例中晚期卵巢癌患者c-erbB-2的扩增率52.2%相近。Wu等[12]对早期卵巢癌的研究发现，c-erbB-2基因的扩增率仅为6.7%，明显低于本实验结果。c-erbB-2基因的扩增率在早期和晚期卵巢癌患者中的显著差异，充分证实c-erbB-2基因的扩增及/或蛋白的过度表达，在人类卵巢癌的发生、发展进程中具有重要作用。本次研究结果显示c-erbB-2癌基因扩增与肿块大小密切相关，肿块<5cm的卵巢癌组织c-erbB-2癌基因的扩增率为25.0%，肿块≥5cm的卵巢癌组织c-erbB-2癌基因的扩增率为67.9%，两者有显著差异，提示c-erbB-2癌基因扩增具有促进细胞增殖的作用。有研究显示c-erbB-2癌基因蛋白产物P185定位于细胞微绒毛及伪足，能加速细胞运动，因此推测P185参与细胞生长的调节，在肿瘤细胞中增殖能力的增强与此有关[13]。

　　本次研究结果还显示c-erbB-2癌基因扩增与临床分期密切相关，临床分期越晚，其扩增和表达也越高。早期卵巢癌c-erbB-2癌基因扩增率为30.8%，中晚期卵巢癌c-erbB-2癌基因扩增率为73.9%，两者有显著差异，与Afify等[14]报道一致。文献也报道晚期卵巢癌患者c-erbB-2癌基因的扩增率高于早期患者[15-16]。故提示c-erbB-2癌基因与肿瘤细胞的增殖活跃、疾病进展密切相关。

　　本实验结果显示，c-erbB-2基因扩增与淋巴结转移、患者年龄、ER、PR均无相关性,与张向宁等[17]、Goff等[18]的研究结果一致。但有淋巴结转移的卵巢癌患者c-erbB-2基因扩增率为65.2%，无淋巴结转移的卵巢癌患者其扩增率为46.2%，两者虽无显著性差异，但有淋巴结转移者其扩增率有明显上升趋势。有研究表明c-erbB-2的过度表达可引起许多基因改变，包括使VEGF/VFPD的表达上调，促进肿瘤新生血管的形成，增加MMP-9、MMP-2的分泌，使肿瘤细胞的运动能力、侵袭能力增强[19]，从而导致癌瘤深部浸润及转移[20]。

　　关于c-erbB-2癌基因扩增与卵巢癌的病理学类型的关系，目前有两种观点，其一为c-erbB-2在上皮性卵巢癌中高表达[21]，其二为c-erbB-2的表达与病理类型无关。本研究结果显示c-erbB-2的扩增与病理类型无关，与大多数的研究结果相一致[22]，提示c-erbB-2癌基因参与了多种来源的卵巢肿瘤的发生、发展。

　　综上所述，在人类卵巢癌中c-erbB-2基因扩增或过度表达具有重要理论和临床意义。它对卵巢癌的恶性程度、癌细胞的侵润、淋巴转移及患者预后的判断具有重要价值，并且c-erbB-2还有希望作为基因治疗和药物作用的靶点，其在卵巢癌的诊断、治疗中意义重大、前景广阔。

　　c-erbB-2基因的检测可在不同的水平上用不同的方法进行。免疫组化简便、易行，不需要特殊的设备。但其试剂不同，敏感性也不同，结果判断也因人而异，实验结果跨度很大，阳性率11.0%~68.9%[23]。近年来出现的差别PCR具有简便、客观、高效等特点，成为检测c-erbB-2的新方法[24]。本实验中我们应用差别PCR检测了36例原发性卵巢癌组织中c-erbB-2的扩增情况，扩增率为58.3%(21/36)，明显高于自身免疫组化法测得的30.6%(11/36)，两者有显著差异。说明差别PCR在检测c-erbB-2的扩增水平上较免疫组化法敏感，临床推广具有实际意义。

　　本次实验应用的差别PCR是一种半定量PCR技术，是用以检测基因拷贝数改变的快速敏感的非同位素技术，已获得日益广泛的应用。其基本原理是将待测靶基因与单拷贝数参照基因在同一反应管中做PCR扩增，然后根据靶基因与参照基因扩增产物的电泳区带的光密度值的比值，评估待测基因扩增程度。本次研究选用β-actin基因作为内参照基因，因为β-actin基因作为管家基因在细胞中表达较为恒定，而且其GC含量与靶基因c-erbB-2相似，保证了两个基因产物有大致相似的扩增效率[25]。该法与传统的Southern Blot等核酸分子杂交技术相比有以下优点：DNA用量小;由于PCR扩增DNA片段仅几十至几百碱基，故对模板DNA质量要求不高;通过内参照基因及目的基因在同一体系中扩增，可减少操作过程中造成的误差，结果较可靠;技术简单、快速，无放射性污染。

　　【参考文献】

　　[1] Eltabbakb GH,Belinson JL,Kennedy AW,et al.P53 and HER-2/neu overexpression in ovarian borderline tumors[J].Gynecol Oncol,1997,65(2):218-224.

　　[2] 苏丽娅，岳秀兰，曹虹然，等.差别PCR技术检测乳腺癌c-erbB-2癌基因扩增的研究[J].包头医学院学报，2006，22(2)：119-121.

　　[3] Shih C,Padhy LC,Munay,et al.Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts[J].Nature,1981,290 (5803):261-264.

　　[4] Bargmann CI,Hung MC,Weinberg RA.The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein[J].Nature,1986,319(6036):226-230.

　　[5] Scott GK,Dodson JM,Montgomery PA,et al. p185HER2 signal transduction in breast cancer cells[J]. J Biol Chem,2001,266(22):14300-14305.

　　[6] Hynes NE, Stern DF. The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its role in cancer[J].Bioch Bioph Acta,2004,1198(2-3):165-184.

　　[7] Fajac A,Benard J,Lhomme C,et al.c-erbB-2 gene amplification and protein expression in ovarian epithelial tumors evaluation of their respective progenostic significance by multivariate analysis[J].Int J Cancer,1995,64:146.

　　[8] Lemoine NR,Staddon S,Dickson C,et al. Absence of activating transmembrane mutations in the c-erbB-2 proto-oncoprotein in human breast cancer[J].Oncogene,2002,5(2):237-239.

　　[9] Charpin C,Garcia S,Bouvier C,et al. c-erbB-2 oncoprotein detected by automated quantitative immunocytochemistry in breast carcinomas correlates with patients overall and disease-free survival[J].Br J Cancer,1997,11(10):1936-1942.

　　[10] 王建勋，岳秀兰，曹虹然，等.应用差别PCR技术研究胃癌中c-erbB-2原癌基因的扩增与胃癌的关系[J].实用肿瘤学杂志，2005,19(5)：14-17.

　　[11] Hogdall EV,Christensen L,Kjaer SK,et al.Distribution of HER2 overexpression in ovarian carcinoma tissue and its prognostic value in patients with ovarian carcinoma:from the Danish"MALOVA"ovarian cancer study [J].Cancer,2003,98:66-73.

　　[12] Wu Y,Soslow RA,Marshall DS,et al. Her/neu expression and amplification in carly stage ovarian surface epithelial neoplasms[J].Gynecol Oncol,2004,95(3):570-575.

　　[13] David BC,Abdul A,Buatamam,et al.Lectin ELISA for the c-erbB-2 Tumor Marker Protein p185 in Patients with Breast Cancer and Controls[J].Clini Chem,1999,45(2):292-295.

　　[14] Afify AM,Werness BA,Mark HF,et al.HER-2/neu oncogene amplification in stageⅠand stageⅢ ovarian papillary serious carcinoma [J].Exp Mol Pathol,1999,66(2):163-169.

　　[15] Wond YF,Cheng TH,Lam SK,et al.Prewalence and significance of HER2/neu amplificantion in epithelial ovarian cancer [J] .Gynecol Obstet Invest,2003,40(3):209-212.

　　[16] Anreder MB,Freeman SM,Merogi A,et al.P53, c-erbB-2 and PCNA statues in benign proliferative and malignant ovarian surface epithelial neoplasms:a study of 75 cases [J].Arch Pathol Lab Med,1999,123(4):310-316.

　　[17] 张向宁，李晓翠,孔北华，等.卵巢上皮性癌中p53基因缺失与HER-2基因扩增及其临床意义[J].实用妇产科杂志，2006，22(2)：89-91.

　　[18] Goff BA，Shy K，Greer BE，et al.Overexpression and relationships of HER2/neu epidermal growth factor receptor P53 and tumor necrosis factor alpha in epithelial ovarian cancer[J].Eur J Gynaecol Oncol，2005，17(6):487-492.

　　[19] Kumar R，Yarmand-Bagheri R.The role of HER2 in angiogenesis [J].Semin Oncol，2001，28(5 Suppl 16):27-32.

　　[20] 陶素芳，马加东，曹金龙.MDR, c-erbB-2和ER,PR在乳腺癌肿的表达[J].现代肿瘤医学，2004，12(6)：525.

　　[21] Skirnisdottir I,Sorbe B,Seidal T,et al.The growth factor receptors HER-2/neu and EGFR their relationship and their effects on the prognosis in early stage(FIGO Ⅰ-Ⅱ) epithelial in ovarian carcinoma [J].Int J Gynecol Cancer,2001,11(2):119-129.

　　[22] 刘履光，杨坤禹.c-erbB-2 nm23和P53蛋白自卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义[J].中华妇产科杂志,1999,34(2)：101-106.

　　[23] Auranen A,Genman S,Kleml P.Immomohistochemically detected P53 and HER2/neu expression and nuclear DNA content in familial epithelial ovarian carcinomas[J].Cancer,1997,79(11):2147-2153.

　　[24] Gerdrum LM,Sorensen BS,Kjeldsen E,et al.Real-time quantitative PCR of microdissected paraffin-embedded breast carcinoma:an alternative method for HER2/neu analysis[J].J Mol Diagn,2004,6(1):42-51.

　　[25] Schreiber G,Dubeau L.c-myc proto-oncogen amplification detected by polymerase chain reaction in archival human ovarian carcinoma[J].Am J Pathol,1990,137(3):653-658.