肿瘤基因治疗的靶向性研究进展

　　作者：唐秋莎，张东生　(东南大学基础医学院病理学与病理生理学系，江苏南京 210009)

　　[摘要] 近年来，肿瘤基因治疗技术迅速发展。其中基因治疗的靶向性是值得密切关注的问题之一。作者就基因治疗靶向性的主要策略如目的基因转移的靶向性和目的基因表达的靶向性两方面作一综述。

　　[关键词] 靶向性;肿瘤;基因治疗;综述

　　随着分子生物学、分子遗传学、免疫学等相关学科的发展和渗透，基因治疗特别是肿瘤基因治疗技术迅速发展，多种肿瘤基因治疗方法在理论和技术上已趋成熟，并从实验及基础研究过渡到临床试用阶段。然而基因治疗并不如当初人们想象的那样完美，它离安全、高效、准确的要求还有一定的差距[1] ，其中基因治疗的靶向性是值得密切关注的问题之一。所谓靶向性，是指在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能，这对于基因治疗是非常重要的。达到基因治疗靶向性的主要策略有目的基因转移的靶向性和目的基因表达的靶向性。作者就近几年来这两个方面的研究进展综述如下。

　　1 目的基因转移的靶向性

　　1.1 病毒介导的靶向基因转移

　　目前用于基因转移的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体等，但它们对细胞的感染均无选择性。逆转录病毒的趋向性由其外壳包膜蛋白env和宿主细胞表面特异的蛋白受体间相互作用决定，因此，可通过修饰env基因或env蛋白来改变其感染谱。用能识别肿瘤细胞受体的配体或抗肿瘤特异性抗原的抗体基因取代env基因部分序列，使病毒表达能特异性识别肿瘤细胞的外壳蛋白，从而将目的基因靶向性地导入肿瘤细胞。Khare等[2] 用抗人癌胚抗原(CEA)单链抗体的基因与env重组，使逆转录病毒把一氧化氮合酶(NOS)“自杀基因”靶向导入CEA阳性的肿瘤细胞，并合成NOS使其自杀身亡，而对非靶细胞则无损伤。

　　腺病毒是双链DNA病毒，其在感染靶细胞时，首先由病毒衣壳纤维蛋白(fiber)中的knob结构域识别并结合细胞表面的“柯萨奇病毒和腺病毒受体”(cox-sackie and aden-ovirus receptor，CAR)，然后通过外壳五邻体蛋白(capsid)与细胞表面的整合素家族分子相互作用，内化进入细胞。因此，目前提高腺病毒感染靶向性方面的改造主要集中于对病毒外壳纤维蛋白的基因改造。Mizuguchi等[3] 选择腺病毒纤维结区的HI环作为靶位点，插入RGD肽段的人工合成寡核苷酸，改造后的重组病毒对CAR- 的人胶质瘤细胞和胰腺癌细胞的感染率均有所提高。体内实验证实，AD.RGD.TNF.α感染CAR- 的人胶质瘤细胞裸鼠模型，仅以1.10的病毒量即可达到与野生型AD.TNF.α相同的治疗效果。Suzuki等[4] 在Ad5.△24(一种E1A突变型肿瘤增生病毒)的病毒外壳纤维蛋白的C末端插入RGD短肽，发现改造后的病毒Ad5.△24RGD抗肿瘤疗效较Ad5.△24显著提高。

　　最近科学家又利用某些病毒先天的特异性感染肿瘤细胞的能力来实现靶向基因转移。研究发现，某些病毒先天具有特异性感染肿瘤细胞和选择性在肿瘤细胞中复制的能力，但其作用机制尚未明确。Phuangsab等[5]通过人神经母细胞瘤裸鼠移植瘤动物模型证实，NDV(new castle disease virus，一种鸡副黏液病毒，能特异性地在肿瘤细胞中复制并溶解肿瘤)瘤内注射可明显抑制肿瘤生长，肿瘤完全消退率高达75%，可望成为治疗肿瘤的理想药物。另有报道，呼吸道肠道过滤性病毒(reovirus)在ras基因处于激活状态的肿瘤细胞中进行复制增生，应用该病毒治疗ras高表达的多种肿瘤取得明显疗效，现已进入临床实验阶段[6，7] 。自主微小病毒(parvovirus)也是一种天然的特异性感染并溶解肿瘤细胞但对正常细胞无毒性作用的病毒，是一种无外壳的、基因组仅5kb的单链DNA病毒[8] 。

　　1.2 受体.配体或抗原.抗体介导的靶向基因转移

　　许多细胞表面都特异性地表达或过表达某种受体或抗原，如果使目的基因或携带有目的基因的载体与相应的配体或抗体相连接，利用受体.配体或抗原.抗体相互作用的特异性，就可以把目的基因特异性地导入到靶细胞中[9] 。Takayanagi等[10] 以抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的单抗B4G7的Fab段，通过多聚赖氨酸(polylysine)与目的基因HSV.TK基因形成亲和复合物，通过EGFR介导的内吞作用将HSV.TK基因导入细胞，其转染效率是用li-pofectin转染的10倍，同时药物敏感性也提高了1000倍。Pu等利用EGFR在大多数胶质瘤中过度表达而在正常脑组织中则低表达的特点，用反义EGFRcDNA转染C6胶质瘤细胞，观察到内生性EGFR mRNA及蛋白水平明显下降，在荷瘤鼠实验中，肿瘤生长明显受抑。

　　1.3 纳米材料介导的靶向基因转移

　　纳米技术对医学领域的不断渗透，使之对肿瘤的治疗也产生了深刻的影响。采用高分子材料制备的纳米载药系统，可以保护核苷酸、防止降解、提高转染效率，并可起到定位和靶向性作用。向娟娟等[11] 制备多聚赖氨酸.磁性氧化铁纳米粒可有效地结合和保护DNA，细胞转染显示，它能高效传递DNA进入HNE1细胞，并产生高水平的绿色荧光蛋白表达。Chen等[12] 采用粒径为10～100nm的NaCl修饰的硅纳米颗粒(SNAP)，使绿色荧光蛋白基因(EGFP.Ni质粒DNA)转染HT1080细胞的效率达70%，高于目前普遍使用的脂质体。

　　2 目的基因表达的靶向性

　　运用特定的基因表达调控元件，或借助于体内体外的物理化学诱导因素，使目的基因特异地在肿瘤细胞中表达，是实现肿瘤基因治疗靶向性的又一重要手段。

　　2.1 肿瘤特异性调控元件调控基因表达

　　许多肿瘤都有其自身特异性的标志物，即肿瘤相关抗原。将治疗基因置于这类抗原的顺式调控元件(如启动子、增强子)的调控之下，可以使目的基因在相应的肿瘤细胞中获得高表达，正常细胞由于缺乏与该顺式调控元件相应的转录激活因子等原因而不表达该 基因。常用的这类顺式元件包括:(1)将AFP启动子与HSV.tk基因相连构建成原发性肝癌特异性自杀基因重组复制缺陷腺病毒载体，将其导入细胞后，使AFP阳性的肝癌细胞系HUH7、HEP.G2获得对TK底物丙氧鸟苷(GCV)的敏感而自杀，AFP阴性的细胞系则对GCV不敏感[13] 。(2)采用癌胚抗原CEA启动子，将其与HSV.tk基因相连，构建成CEA阳性肿瘤(如胰腺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌)细胞特异性自杀基因载体[14] 。(3)根据乳清酸性蛋白(WAP)及MMTV等基因只在乳腺中特异表达的特性，将这些基因启动子区内存在的负调控元件与HSV.TK基因相连，构建成乳腺癌特异性自杀基因载体。(4)端粒酶(telomerase)启动子。端粒酶是一种用以合成染色体中DNA末端重复序列(端粒)的酶，其基因特异性地转录并表达于多数肿瘤细胞中。端粒酶的作用在于它可以阻止细胞分裂过程中端粒的进行性降解，从而维持染色体结构的完整，促进细胞无限期分裂和癌变。Gu等[15] 构建了端粒酶催化亚基的启动子控制下的bax基因腺病毒表达载体，体内感染证实了其对肿瘤细胞的特异杀伤作用。

　　2.2 组织特异性调控元件调控基因表达

　　这类调控元件与肿瘤特异性调控元件并没有严格的界限，外源基因在组织特异性启动子调控下，可使基因治疗局限于发生癌变的组织和器官中，而不至于给其它组织带来损害。Selvakumaran等[16] 从鼠卵巢中分离得到462bp的卵巢特异性启动子，并用于卵巢癌的基因治疗;Latham等[17] 研究发现，前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺组织的重要标记抗原，在前列腺癌细胞中表达显著增高，因此利用PSA启动子及其1455bp增强子来构建前列腺癌特异的基因治疗载体，以达到靶向性治疗前列腺癌的目的。

　　3 结语

　　靶向基因治疗作为基因治疗研究的热点已取得了较大的进展，但无论是哪种方法，或多或少都存在缺陷。与非病毒载体相比，病毒载体基因转移效率高、稳定性强，却有安全性及容量限制等问题。利用受体来获得靶向性并不总能成功，因为配体的插入会影响载体的空间结构，使其介导的载体构象变化在随后的内吞过程中不能发生改变，内吞后的内吞体很容易和细胞内的溶酶体融合，使目的基因被酶降解。使用外源性启动子或外源性DNA序列对于基因的长期表达也存在障碍，因为机体能识别外源性序列并降解它们。但不管怎样，基因治疗的靶向性研究已取得了很大的进展，我们有理由相信随着基础科学研究的进一步深入，基因治疗的靶向性必将取得新的突破。

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