三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响

　　作者：王南瑶，刘琳，邱少敏，赵伟，秦叔逵，陈惠英，李苏宜(东南大学附属中大医院肿瘤科，江苏南京 210009;南京市肿瘤医院，江苏南京 210003;中国人民解放军第八一医院全军肿瘤中心，江苏南京 210002)

　　[摘要]目的: 研究三氧化二砷(As 2 O 3 )注射液对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位人端粒逆转录酶(hTERT)表达的影响。 方法: 建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型，随机分为生理盐水组、As 2 O 3 低剂量(2.5mg?kg -1 )组、As 2 O 3 高剂量(5mg?kg -1 )组及5.FU(20mg?kg -1 )组。腹腔注射As 2 O 3 ，利用银染.端粒重复扩增(TRAP)法测定人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性、RT.PCR法检测hTERT的表达。结果: 生理盐水组及5.FU组端粒酶活性及其催化亚单位表达不受影响，不同剂量As 2 O 3 均明显抑制端粒酶活性及其催化亚单位表达。 结论: As 2 O 3 注射液对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位的表达有抑制作用。

　　[关键词] 三氧化二砷;结肠肿瘤;裸鼠;端粒酶

　　三氧化二砷(As 2 O 3 )注射液治疗急性早幼粒细胞白血病已取得肯定疗效。实体瘤体外实验表明，As 2 O 3 对肝癌、肠癌等多种肿瘤细胞有抑制作用[1，2] ，并有临床报道As 2 O 3 治疗肝癌取得一定疗效[3]。本研究通过动物实验观察As 2 O 3 对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位人端粒逆转录酶(human telomerase reverse transcriptases，hTERT)表达的影响，进一步探讨As 2 O 3 的抗肿瘤机制，为临床应用As 2 O 3 注射液治疗结肠癌提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　实验动物为BALB.C裸小鼠，3～5周龄，雄性，体重18～22g，购自中国科学院上海实验动物中心[许可证号SCXK(沪)2003.0003]，饲养于SPF动物房。

　　1.2 药物及试剂

　　0.1%As 2 O 3 注射液系哈尔滨伊达药业有限公司产品(国药准字H20030347);5.FU注射液系天津金耀氨基酸有限公司产品(国药准字H12020959)。Tripur-eRNA提取试剂盒购自德国ROCHE公司;TAKARA一步法RT.PCR反应试剂盒购自大连宝森公司;银染.端粒重复扩增(TRAP)试剂自配(TaqDNA聚合酶、dNTP购于Promega公司，CHAPS、PMSF、EGTA购于Sigma公司，其他均为国产分析纯)。

　　1.3 移植瘤模型制备及分组

　　人未分化结肠腺癌细胞株LoVo培养于含10%小牛血清的1640培养液中，在37℃、CO 2 体积分数为0.05的条件下培养，细胞呈单层贴壁生长，每2～3d传代1次。收集并调整细胞数为1×10 7 ml -1 。在无菌条件下裸小鼠右前肢背部皮下注射2×10 6 (0.2ml) -1 的LoVo细胞，注射局部出现明显皮丘，4～6d后出现结节，移植瘤模型建立。40只裸小鼠均被制成LoVo细胞移植瘤模型，然后随机分生理盐水组、As 2 O 3 低剂量(2.5mg?kg -1 )组、As 2 O 3 高剂量(5mg?kg -1 )组及5.FU(20mg?kg -1 )组4组，每组10只。

　　1.4 用药及处理

　　所有裸小鼠均于接种后第7天开始腹腔注射给药，按各组所定浓度，每次0.5ml，1次?d -1 ，连续用药14d，停药次日处死裸鼠，解剖剥离肿瘤，取瘤组织约60mg用PBS缓冲液洗净血液后置-20℃储存，待检测端粒酶活性。

　　1.5 端粒酶活性检测(银染.TRAP法)

　　(1)端粒酶引物:Ts引物序列为5′.AATCCGT CGAGCAGACAGTT.3′，Cx引物序列为5′.CCCTTACCCT TACCCTTACCCTAA.3′，以上引物由上海SANGON公司合成。(2)细胞提取物制备:取手术标本60mg左右，加100μl细胞裂解液，冰浴30min，16000r?min -1 离心30min，取上清液，-20℃备用。(3)TRAP反应:取1μl细胞提取液，加入TRAP反应液(含1mg?L -1 Ts引物，2UTaqDNA聚合酶，5mmol?L -1 dNTP)。反应体积50μl，30℃保温30min。(4)PCR扩增:加Cx引物(0.1mg?ml -1 )1μl进行PCR扩增，94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环。(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取扩增产物25μl，在12%的聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳(150～200V，2h)，电泳结束后取下凝胶进行银染色。

　　1.6 hTERT.mRNA检测

　　(1)hTERT引物:上游，5′.CGGAAGAGTGTCTG GAGCAA.3′;下游，5′.GGATGAAGCGGAGTCTGGA.3′。GAPDH引物:上游，5′.ACGGATTTGGTCGTATTGGG.3′;下游，5′.TGATTTTGGAGGGATCTCGC.3′。以上引物均由上海SANGON公司合成。(2)RT.PCR检测hTERT.mRNA:采用ROCHE公司的Tripure试剂盒，按操作程序操作，提取总RNA，采用TAKARA一步法逆转录试剂盒进行PCR扩增，产物以2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察成像。阳性标本在235bp处出现明显条带。

　　2 结果

　　2.1 As 2 O 3 抑瘤作用

　　用药结束后测定肿瘤结节的长(a)、宽(b)、高(c)，按公式计算肿瘤体积(V.cm3 )=πabc.6，结果见表1。肿瘤体积抑制率=(1-用药组平均瘤体积.对照组平均瘤体积)×100%。可见As 2 O 3 对人结肠癌裸鼠移植瘤有明显抑制生长作用，但各用药组之间无明显差异。

　　表1 As 2 O 3 对人结肠癌裸鼠移植瘤的影响(略)

　　注:经方差分析，各用药组与生理盐水组比较，P<0.05;各用药组间比较，P>0.05

　　2.2 As 2 O 3 对裸鼠移植瘤hTERT.mRNA表达水平的影响

　　见图1。生理盐水组和5.FU组在235bp处出现 明显条带，与阳性对照无明显差异，而As 2 O 3 低剂量、高剂量组均表达阴性，表明生理盐水组和5.FU组端粒酶催化亚单位表达未受影响，低、高剂量As 2 O 3 均明显抑制其表达。

　　1.生理盐水组;2.As 2 O 3 低剂量组;3.As 2 O 3 高剂量组;4.5.FU组;5.阳性对照HeLa细胞;M.Marker

　　图1 裸鼠移植瘤端粒酶催化亚单位hTERT表达检测结果(略)

　　2.3 As 2 O 3 对裸鼠移植瘤端粒酶活性的影响

　　见图2。端粒酶表达阳性对照为人宫颈癌HeLa细胞。由图2可见，生理盐水组、5.FU组端粒酶活性不受影响，仍为强阳性;As 2 O 3 低剂量组、高剂量组均表达阴性。

　　1.生理盐水组;2.As 2 O 3 低剂量组;3.As 2 O 3 高剂量组;4.5.FU组;5.阳性对照HeLa细胞

　　图2 裸鼠移植瘤端粒酶活性检测结果(略)

　　3 讨论

　　端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构，对维持染色体稳定性和DNA完整复制具有重要作用。随着细胞的分化和发育，端粒DNA越来越短以至消失，造成染色体不稳定，从而使细胞死亡。端粒酶是维持端粒长度的逆转录酶，以自身RNA为模板合成端粒重复序列。端粒酶是一种核糖核蛋白，由端粒酶RNA成分、催化亚单位和端粒酶相关蛋白三部分组成。端粒酶RNA提供逆转录合成端粒DNA的模板;hTERT被认为是端粒酶催化亚单位，是端粒酶激活的限速因素。端粒酶通过合成新的端粒，从而保证端粒DNA不会随细胞分裂而缩短。研究发现[4] ，正常体细胞中端粒酶活性很低，而恶性细胞中却有很高的端粒酶活性;hTERT表达水平与端粒酶活性显著相关[5] 。端粒酶通过稳定端粒，使肿瘤细胞无限制分裂增殖。根据以上端粒、端粒酶与肿瘤生长、发展的关系，通过抑制端粒酶催化亚单位表达，降低端粒酶活性，造成端粒的缩短乃至消失，最终导致肿瘤细胞死亡，从而达到治疗肿瘤的目的。因此端粒酶抑制剂成为目前探索中的治疗肿瘤的新手段。

　　新近在体外实验中[6，7] 发现，As 2 O 3 注射液可抑制某些肿瘤细胞hTERT-mRNA表达并降低端粒酶活性。作者研究了不同浓度As 2 O 3 对裸鼠人结肠癌LoVo细胞移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响，结果显示，As 2 O 3 能有效地抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长，低剂量和高剂量As 2 O 3 均能明显降低裸鼠人结肠癌LoVo细胞移植瘤端粒酶催化亚单位表达水平，并抑制端粒酶活性，说明抑制端粒酶是其抗肿瘤作用机制之一，为临床应用As 2 O 3 注射液治疗结肠癌提供了实验依据。5.FU组无端粒酶抑制作用，此与文献报道[8] 相同。本研究仅定性反映了As 2 O 3 注射液对端粒酶的抑制作用，至于不同浓度As 2 O 3 的抑制作用有无差别，尚待进一步研究。

　　[参考文献]

　　[1]秦叔逵，陈洪，陈惠英，等.三氧化二砷诱导人肝癌细胞株凋亡的实验研究[J].临床肿瘤学杂志，1998，3(2):40.

　　[2]刘琳，邱少敏，赵伟，等.三氧化二砷诱导人类大肠癌细胞凋亡及其分子机制的研究[J].世界华人消化杂志，2004，11(7):1550.1554.

　　[3]钱军，秦叔逵，何泽民，等.三氧化二砷治疗中晚期原发性肝癌的临床研究[J].中华肝脏病杂志，2002，10(1):63.64.

　　[4]YOSHIDA K，SUGINO T，GOODISON S，et al.Detection of te-lomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal wash-ing and its related clinical implications[J].Bio J Cancer，1997，75(10):548.553.

　　[5]NAKAYAMA J，TAHARA H，TAHARA E，et al.Telomerase ac-tivation by hTRT in human normal fobroblasts and hepatocellular carcinomas[J].Nat Genet，1998，18(1):65.68.

　　[6]吕秀宁，郑杰.As 2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡与细胞内端粒酶活性关系的研究[J].东南大学学报(医学版)，2003，22(4):227.229.

　　[7]马学斌，谷志远，宋海静，等.三氧化二砷对HeLa细胞hTERT-mRNA表达的调节和对端粒酶活性的影响[J].军医进修学院学报，2004，25(1):26.28.

　　[8]何守搞，夏忠胜，朱兆华.ATRA和5.FU对胃癌细胞端粒酶活性的影响及其抗癌作用[J].中山医科大学学报，2000，21(5):325.329.

　　[基金项目] 南京市医学科技发展专项基金重点项目(ZKG0018)。