组织芯片技术在乳腺癌相关指标检测中的应用

　　作者：李洪涛 宁连胜 张斌 (1.河北北方学院附属第一医院肿瘤外科，河北 张家口 075000;2.天津医科大学附属肿瘤医院乳腺一科，天津 300070)

　　【摘要】 目的:探讨组织芯片免疫组化方法在乳腺癌相关指标检测中的应用。方法：采用组织芯片免疫组化和传统免疫组化的方法分别检测了183例和30例乳腺癌组织中MMP2，MMP9， MMP13的表达水平。结果：组织芯片免疫组化染色与传统免疫组化染色不存在统计学差异(P>005)。结论：高通量组织芯片免疫组化的方法在乳腺癌相关指标检测中可一次对多个样本进行多指标检测，大大节省了人力、物力和财力，值得进一步推广使用。

　　【关键词】 组织芯片;免疫组化;乳腺癌

　　The Application of Microarray Immunohistochemical Technique in

　　the Detection of the Index Correlated with Breast Cancer

　　LI Hongtao1, NING Liansheng2, ZHANG Bin2

　　1. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital， Heibei North University,

　　Zhangjiakou, 075000, Hebei， China; 2. Department of Breast, The Affiliated Cancer

　　Treatment Hospital， Tianjin Medical University, Tianjin, 300070, China

　　【ABSTRACT】 Objective: To investigate the application of Microarray immunohistochemical technique in the detection of the index correlated with breast cancer. Methods: MMP2, MMP9 and MMP13 were detected by Microarray immunohistochemical technique and traditional immunohistochemical technique in 183 patients and 30 patients with breast cancer respectively. Results: Microarray immunohistochemical technique has no significant difference compared with traditional immunohistochemical technique. (P>005). Conclusion: Highflux Microarray immunohistochemical technique can detect several indexes for many samples one time in the detection of the index correlated with breast cancer. It could save manpower, materials and financial resources. It is worth to be spread and applicated.

　　【KEY WORDS】 Microarray, Immunohistochemical technique, Breast cancer

　　组织芯片(tissue microarray，TMA)是将多个微小组织片汇集在一张固相载体上所形成的组织微阵列生物芯片，简称组织芯片。TMA克服了传统病理学技术步骤繁琐、试验速度慢和效率低的缺点，具有小体积、多样本、大信息、可同时分析数百种组织样品的优点。本研究中我们采用组织芯片免疫组化的方法检测了183例乳腺癌组织中MMP2，MMP9，MMP13的表达水平，同时采用传统免疫组化的方法对其中30例进行相同指标的检测，并对其阳性率进行比较，目的是为组织芯片免疫组化方法在乳腺癌相关指标检测中的应用进一步提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　11 材料 试验组：天津医科大学附属肿瘤医院乳腺病理科1993年手术切除乳腺癌石蜡包埋标本183例。年龄24~75岁，平均4926岁。浸润性导管癌124例，浸润性小叶癌28例，其他类型癌31例。临床分期Ⅰ期22例，Ⅱ期93例，ⅢⅣ期68例。组织学分级I级67例，Ⅱ级57例，Ⅲ级59例。有淋巴结转移者97例，无淋巴结转移者86例。对照组：于183例中按>10%的抽样比例随机选取30例作为对照组。

　　12 方法

　　121 制作组织芯片 ①HE切片于显微镜下明确并标记癌巢。②借助HE切片于供体蜡块的相应部位进行标记作为取材部位。③组织芯片模块制作：将普通病理石蜡熔化，反复沉淀3次，加入3%精制蜂蜡，制作40cm×20cm×10cm大小的空白蜡块，室温冷却。④组织芯片的设计和制备：设计10×8点组织列阵，用打孔机制成模块，用直径06mm的打孔针从供体蜡块的选定部位逐个取出组织芯，随即放入预先设计的阵列模块中，排列成组织芯片模块，将制成的组织芯片模块置于60℃温箱中50min，轻压模块使组织芯在模块中排平。将制成的模块常规切成4μm的切片裱于硅化玻片上，60℃温箱过夜。

　　122 对照组切片制备 将病理蜡块切成4μm的切片裱于硅化玻片上，60℃温箱过夜。

　　123 采用免疫组织化学SP法检测 鼠抗人MMP2，MMP9，MMP13单克隆抗体均购自北京中杉生物技术有限公司。SP试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司，按说明书要求做抗原热修复处理。用己知阳性的乳腺癌组织切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　13 阳性结果判断标准 结果判断按Shimizu方法[1]，对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色<1/3、1/3～2/3、>2/3分别打0、1、2、3分，然后根据两项打分之和判断其结果：0分为阴性，≥ 3分为阳性，其中5分者为强阳性(注：每张切片选择有代表性的区域，在400倍视野下进行计数，共计5个视野，取其平均值以避免随意性)。

　　14 统计学方法 组织芯片免疫组化染色与传统免疫组化染色阳性率的比较采用行×列表进行χ2检验，α值等于005为显著检验水准。用SPSS 130统计软件进行分析。

　　2 结果

　　实验组MMP2染色阳性141例，阳性率为770%;MMP9染色阳性120例，阳性率为656%;MMP13染色阳性99例，阳性率为541%。对照组MMP2染色阳性23例，阳性率为767%;MMP9染色阳性20例，阳性率为667%;MMP13染色阳性16例，阳性率为533%。结果显示组织芯片免疫组化染色与传统免疫组化染色不存在统计学差异(P>005)，详见表1。

　　3 讨论

　　1998年Kononen等[2]在《Nature》杂志上发表了“组织芯片在肿瘤分子高通量分析中的应用”，为病理学及生物分析技术开辟了新的领域。组织芯片可根据实验要求和目的，设计出不同的排列组合，在疾病的分子诊断、流行病学调查、个体化治疗、预后指标筛选以及新基因的发现等方面发挥重要作用[2~7]。

　　31 组织芯片的优点和局限性表1 组织芯片与传统免疫组化染色的比较

　　311 优点包括：(1)高产出：一次实验可得到大量结果;(2)实验误差小，组织芯片中的众多组织都处在相同条件下进行实验，因此较传统的一个病例一张切片的实验误差小;(3)省时、省力、节约开支;(4)对原始组织蜡块损坏小：病理组织蜡块，特别是少见病例和有研究价值的蜡块，常常是病理医生的“宝贝”，不愿借出。原因之一是担心组织损坏太大。由于制作组织芯片钻取的组织很小(直径06mm～20mm)，对原组织蜡块损坏不大，因此，易于开展合作及建立合作网。

　　312 局限性包括：(1)组织芯片因取材较小，因此必须做到取材准确才能确保取材有代表性，国外有报道，利用立体显微镜强光照射选取组织核心，能提高组织阵列制作的准确性，(2) 组织芯片免疫组化不能准确定量，不能用于癌前病变组织[2]。(3)因一张切片中组织量太少，做组织分析判定有一定困难。

　　32 组织芯片的可信度的评价由于组织芯片中的微组织样本均来源于原始供体蜡块，因此，组织样本的大小能否代表供体标本信息成为这一技术是否可靠的理论基础，也是实验者所关心的焦点问题。理论上，06mm直径的组织样本可包含600～1300个以上细胞，足可以反映原组织结构的信息[2]。Hoos A等[8]在研究59例纤维细胞瘤的肿瘤表型时发现，无论应用组织芯片技术还是传统制片方法，Ki 67、P53、和pRB蛋白的表达均无差异。Mucci等[9] 分别用普通方法和组织芯片技术对50例前列腺肿瘤中CGA和SYN呈异质性表达的神经内分泌标记进行观察，结果发现两组中CGA和SYN的表达也无差异。Gillett等[10] 通过对157例乳腺癌标本中ER、PR表达的研究发现，普通方法和组织芯片技术，尽管分别有50% 和65% 的病例的ER、PR的表达结果不一致，但整体而言，两种方法所取得的结果仍具有显著的相关性和一致性。我们的研究结果表明：组织芯片免疫组化在乳腺癌相关指标检测中与传统免疫组化无明显区别，具有与传统方法同样的敏感性和准确性，提示高通量组织芯片免疫组化的方法在乳腺癌相关指标检测中可一次对多个样本进行多指标检测，大大节省了人力、物力和财力，值得进一步推广使用。

　　参考文献

　　1 Shimizu M, Raitoh Y, Ltoh H, et al. Immunohistochemical staining of Haras oncogene product in normal, benign, and malignant human pancreatic tissues[J].Hum Pathol, 1990, 21(6):607612

　　2 Kononen J,Bubendorf L,Kallioniemi A,et al.Tissuemicroarrays for high throughput molecular profiling of tumor of specimens[J].Nature Med,1998,4:844

　　3 Rlmmal I,Camp RL,Chattte LA,et al.Tissue microarray：a new technology for amplification of tissue resource[J].Cancer J,2001,7:24

　　4 黄晓峰,张远.组织的取材和固定方法.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000.61

　　5 Kallioniem OP,Wagner U,Konorlerl J,et al.Tissue microarray technology for highthroughput molecular profiling of cancer[J].Hum Mol Genet,2001, 10:657

　　6 Bubendof L, Nocito A, Mech H, et al.Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for highthroughput in situ studies[J]. J Pathol, 2001, 195:72

　　7 Moch H, Kononen J. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic[J].Pathology, 2001, 8:4

　　8 Hoos A, Urist MJ, Stojadinovic A, et al. Validation of tissue microarrays for immunohistochemical profiling of cancer specimens using the example of human fibroblastic tumors[J]. Am J Patho1, 2001, 158:12451251

　　9 Mucci NR, Akdas G, Manely S, et al. Neuroendocrine expression in metastatic prostate cancer： evaluation of high throughput tissue microarrays to detect heterogeneous protein expression[J]. Hum Pathol，2000, 31:406414

　　10Gillett CE, Springall RJ, Barnes DM, et al.Multiple tissue core arrays in histopathology research: a validation study[J]. J Pathol, 2000, 192: 549553