膜糖蛋白介导的肺癌耐药与逆转机制的研究现状

　　作者：许德国 王潍博 作者单位：山东大学省立医院肿瘤化疗科，山东 济南 250021

　　【关键词】 肺肿瘤;多药耐药;P-糖蛋白;多药耐药相关蛋白;肺耐药相关蛋白

　　尽管近年来肺癌的诊疗技术有了很大提高，但5年生存率仍不足15%〔1〕，其主要原因是化疗对肺癌，尤其是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)效果不佳，多药耐药(multidrug resistance，MDR)是其主要原因。MDR是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药现象后，对其他结构、细胞靶点和作用机制迥然不同的化疗药物产生交叉耐药。肺癌的耐药机制比较复杂，是多基因、多种途径共同作用的结果，MDR相关膜糖蛋白表达增高、细胞内代谢酶活性异常、信号转导有关因子的表达异常是MDR的物质基础，如何逆转MDR导致的化疗失败是目前研究的热点。本文对近年来膜糖蛋白介导的肺癌化疗MDR与逆转机制的研究进展做一总结。

　　1 膜糖蛋白介导的耐药机制

　　此类膜糖蛋白主要有P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)、肺耐药相关蛋白(lung resistance protein，LRP)等。

　　1.1 P-gp 1976年Juliano首先在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现一种分子量(Mr)为170 kD的糖蛋白，即P-gp。P-gp基因位于人染色体7q21.1，为三磷酸腺苷(ATP)依赖性膜转运蛋白，能将疏水亲脂性的药物，包括蒽环类抗生素(如柔红霉素、阿霉素)、植物碱类抗肿瘤药(如长春新碱、鬼臼乙叉甙)、丝裂霉素、放线菌素等泵出细胞外，降低细胞内抗癌药物的浓度，使药物无法对肿瘤细胞有效杀伤而引起MDR。Hida〔2〕等研究显示肺癌P-gp阳性表达率为64.8%(46/71)，NSCLC高于SCLC，腺癌高于鳞癌，尤以中-高分化腺癌中表达较高，这与其对化疗不敏感相符，P-gp表达与肺癌分期无关。

　　1.2 MRP MRP是由人16pl3.1基因编码的Mr为190 kD的蛋白。MRP与P-gp都是与MDR相关的膜结合蛋白，都由跨膜的疏水区和胞浆内亲水区域组成，亲水区有高度同源性，是ATP结合位点，这些结构相似的转运蛋白家族称为转运蛋白ABC超家族。二者有15%的氨基酸同源，同源的部分均位于ABC家族高度保守的核酸结合区域内〔3〕。尽管它们介导的耐药主要是依赖能量的外排发挥作用，但它们之间还存在一些差异。MRP在正常细胞中大多数位于内质网、高尔基体和胞质运输囊泡等内膜系统上，少数位于细胞膜，但在肿瘤细胞中则相反，主要定位于细胞膜上〔4〕。MRP 在肿瘤细胞MDR中的作用，除了有“药物外排泵”的作用外，还可能通过改变细胞内的药物分布产生耐药性。在MRP过度表达的细胞中发现蒽环类化疗药物主要集聚于细胞核周围区域和胞质囊泡中，胞核内很少。而在MRP 低表达的药物敏感细胞中，药物分布有很高的核浆比〔5〕。MRP mRNA在NSCLC的表达阳性率80.5%，从高到低依次为腺癌、鳞癌、腺鳞癌〔6〕。现已有多项研究认为MRP与肺癌对铂类药物耐药有关。芮萌等〔7〕研究发现肺癌组织中P-gp、MRP均有不同程度的过表达，阳性率分别是61.3%和58.4%，且P-gp与MRP共表达率高，而正常肺组织中未见P-gp、MRP的表达，提示P-gp、MRP可能通过一定的协同作用来参与肺癌细胞MDR。

　　1.3 LRP 1993年Scheper等在非P-gp表达的NSCLC细胞株SW1573/ZR120中最先发现了一种对阿霉素、Vp-16、长春新碱产生耐药性，Mr为110 kD的蛋白表达。由于最初发现于肺癌细胞中，故称该蛋白为LRP〔8〕。在具有分泌功能的上皮组织中表达较高，如支气管上皮。LRP是非ATP依赖性转运蛋白，参与核与胞质间的药物转运，将化疗药物储存入胞质内囊泡，使靶点药物有效浓度下降，并以胞吐的方式排出细胞而产生耐药。Sugawara 等〔9〕应用RT-PCR 方法检测术前未经化疗、放疗的肺癌细胞组织与相应的癌旁5 cm以外的肺组织中LRP mRNA表达，发现前者的阳性表达率和强度高于后者，推测LRP表达可能是肺癌天然耐药的分子生物学基础。腺癌LRP表达阳性率和强度高于鳞癌，与临床上鳞癌较腺癌对化疗敏感相符。在不同病理分级、不同临床分期的肺癌组织中LRP mRNA表达无显著性差异。

　　2 逆转膜糖蛋白介导的耐药策略及应用前景

　　肺癌化疗方案最大的障碍是癌细胞的耐药性，克服此障碍肺癌化疗将取得重大突破。

　　2.1 抑制膜糖蛋白的功能

　　该类药物可竞争性、非竞争性或变构性地阻滞膜糖蛋白与化疗药物的结合位点，从而逆转肿瘤细胞的耐药性。根据抑制剂与膜糖蛋白结合的特异性以及亲和性大小，可分为数种。目前膜糖蛋白抑制剂已有三代产品出现。第一代抑制剂：该类抑制剂与膜糖蛋白结合的特异性与亲和性不高，在临床上有各自的适应证，且在体内用于抑制药物外排泵作用的剂量较高，副作用明显，因此在临床上的应用受到限制。代表药物有利血平(reserpine)、维拉帕米(verapamil)、环孢素A(CsA)、他莫昔芬(tamoxifen)和托瑞米芬(toremifen)等。第二代抑制剂：该类抑制剂代表药物有：PSC833(valspodar)、VX-710(biricodar，incel)、MS-209、GF120918和右旋维拉帕米(dexverapamil)等〔10～12〕。PSC833是环孢素D的衍生物，活性比CsA高，且没有CsA的免疫抑制作用。VX-710为哌啶类衍生物，是广谱外排泵抑制剂，对P-gp和MRP1同时具有抑制作用。MS-209是一新颖的喹啉衍生物，与化疗药物联合用药可以逆转人小细胞肺癌(SCLC)的耐药性，并且能够抑制其组织转移。GF120918是一个合成的吖啶类P-gp介导的MDR抑制剂。该类抑制剂与第一代相比，有较高的膜糖蛋白亲和性，且没有第一代抑制剂所具有的药物副作用，但却能引起复杂的药物间相互作用，在临床上的应用还待深入研究;第三代抑制剂：目前处于研究之中的药物有LY335979、XR9576和OC144-093等〔13～15〕。LY335979为喹啉类衍生物，是一个高效、高选择性的P-gp抑制剂。它对P-gp有很高的亲和力，在抑制P-gp的浓度下不抑制MRP，与阿霉素合用治疗晚期恶性肿瘤的一期临床试验已经完成。XR9576是邻氨基苯甲酸衍生物，可以特异性地抑制P-gp。不论口服还是静脉给药，其均可发挥持续的抑制作用，并且耐受性良好，已经通过一期临床安全性评价。OC144-093是新的咪唑类化合物，其本身没有细胞毒性，在低剂量下就可逆转耐药癌细胞对阿霉素、长春新碱等的耐药性。与前两代抑制剂相比，第三代抑制剂具有较高的抑制活性和选择性，并且克服了第二代抑制剂与药物相互作用的缺点，不影响药物的动力学性质，临床应用前景广阔。

　　2.2 抑制膜糖蛋白的表达

　　MDR相关的膜糖蛋白基因首先转录为mRNA，经修饰后翻译为具有活性的蛋白。作用于上述某一环节，可影响膜糖蛋白的表达水平，从而逆转肿瘤细胞的耐药性。目前用于动物细胞水平的逆转策略包括：①基因敲除：敲除与肿瘤细胞耐药密切相关的膜糖蛋白基因。敲除MRP不影响小鼠正常的生存和各项生理指标〔16〕，而与MRP同属ABC转运膜蛋白家族的P-gp基因(mdr1)敲除则有可能损害小鼠肠道的正常防护功能产生严重副作用〔17〕，因此选择合适的逆转MDR的敲除靶基因是关键所在。②反义核酸策略：反义核酸技术作为一种新的分子生物学工具,近年来受到越来越多的重视。其基本原理是通过碱基配对特异性地与某些DNA或RNA结合阻碍其复制、转录和翻译，达到封闭基因并抑制其表达作用。Gao等〔18〕分别把携有mdr1、MRP的反义RNA逆转录病毒导入阿霉素选择出的人NSCLC细胞(GAOK)，细胞对阿霉素、长春花碱、秋水仙碱的耐药度减少40%～50%，而共转染mdr1和MRP基因的反RNA后发现，P-gp、MRP的表达分别减少64%、93%，对上述化疗药耐药程度减少97%左右。实验显示P-gp、MRP在GAOK细胞株耐药过程中共同起作用，共转染两者的反义RNA可协同逆转耐药。③核酶技术：核酶是一类具有酶活性的RNA分子，能催化RNA的剪接和剪切反应，这种作用无需能量就能使RNA被降解，无法进行转录和翻译，而且催化效率很高，一分子核酶可切割多分子的靶RNA，自身不被消耗可重复使用。核酶的基因组成分两部分：中间的极为保守的核苷酸序列(活性中心)和两端的引导序列，引导序列与靶RNA互补结合时，中间保守序列即在该特定位点切断，从而具有高度特异性〔19〕。另外，核酶不编码蛋白质，无免疫原性。由于其高效率、高特异性、少副作用的特点，核酶在基因治疗中备受青睐，在治疗肺癌耐药方面得到广泛的研究〔20〕。

　　2.3 间接对抗MDR的基因治疗

　　肿瘤化疗的另一障碍是药物对人体正常组织尤其是造血系统的损伤，从而限制了化疗药物的使用剂量而影响化疗效果。如果将MDR基因转入正常骨髓细胞，则可使骨髓细胞抵抗化疗药物的能力增强。在提高宿主耐药性方面，已建立了人mdr1骨髓转基因小鼠模型。Galski等〔21〕将人MDR1 cDNA克隆转入一质粒中，将这一质粒用于产生转基因小鼠，转基因MDR1主要在骨髓和脾脏表达，而用柔红霉素治疗转基因小鼠时，白细胞数量没有下降，这表明骨髓细胞已获得对药物细胞毒性作用的抵抗力，而其他组织器官仍对抗癌药物敏感，这个结果揭示细胞在体外导入MDR1基因，然后再回输到患者体内，使患者的骨髓细胞免受抗癌药物的损伤，可以给患者较大量的抗癌药，以达到化疗的目的。除了在化疗期间保护药敏组织外，在淋巴细胞系转染MDR1基因可保护免疫系统的功能不受破坏，将MDR1基因转染其他类型的细胞使之合成分泌一些物质而减轻肿瘤相关的并发症或降低肿瘤细胞局部浸润或转移的能力。

　　随着MDR机制的深入研究及逆转方法的不断改进，人类最终能够克服肿瘤的MDR现象，在肺癌的防治方面做出突破性进展。

　　【参考文献】

　　1 孙 燕，石远凯.临床肿瘤内科手册〔M〕.第5版.北京：人民卫生出版社，2007：25.

　　2 Hida T，Kuwabara M，Arigoshi Y，et al.Serum glutathion S-transferase π level as a tumor marker for non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer，1994;73:1377-82.

　　3 Tan B，Piwnica-Worms D，Rather L.Multidrug resistance transporters and modulation〔J〕.Curr Opin Oncol，2000;12(5):450-8.

　　4 Borst P，Evers R，Kool M，et al.A family of drug transporters:the multidrug resistance-associated proteins〔J〕.J Natl Cancer Inst，2000;92(16):1295-302.

　　5 Cole SP，Deeley RG.Multidrug resistance mediated by the ATP-binding cassette transporter protein MRP〔J〕.Bioassays，1998;20(11):931-40.

　　6 Campling BG，Young LC，Baer KA，et al.Expression of the MRP and MDR1 multidrug resistance genes in small-cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，1997;3(1):115-22.

　　7 芮 萌，李龙芸，刘丽华.肺癌组织中P-gp、MRP、P53蛋白的表达及其临床意义〔J〕.海军总医院学报，2003;16(4):201-5.

　　8 Scheper RI，Broxterman HJ，Sehefcr GL，et al.Overexpression of aM(r)1110，000 vesicular protein in non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance〔J〕.Cancer Res，1993;53(7)：1475-9.

　　9 Sugawara I,Akiyama S,Scheper RJ,et al.Lung resistance protein (LRP) expression in human normal tissues in comparison with that of MDR1 and MRP〔J〕.Cancer Lett，1997;112(1)∶23-31.

　　10 Tan B,Piwnica-Worms D，Ratner L.Multidrug resistance transporters and modulation〔J〕.Curr Opin Oncol,2000;12(5):450-8.

　　11 Bates S，Kang M，Meadows B,et al.A phase Ⅰ study of infusional vinblastine in combination with the P-glycoprotein antagonist PSC 833 (valspodar)〔J〕.Cancer，2001;92(6):1577-90.

　　12 Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein〔J〕.Cancer Control，2003;10(2):159-65.

　　13 Dantzig AH，Shepard RL，Cao J,et al.Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by a potent cyclopropyldibenzosuberane modulator，LY335979〔J〕.Cancer Res，1996;56(18):4171-9.

　　14 Mistry P，Stewart A，Dangerfield W,et al.In vitro and in vivo reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by a novel potent modulator,XR9576〔J〕.Cancer Res，2001;61:749-58.

　　15 Guns ES，Bullock PL，Reimer ML,et al.Assessment of the involvement of CYP3A in the vitro metabolism of a new modulator of MDR in cancer chemotherapy，OC144-193，by human liver microsomes〔J〕.Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2001;26(4):273-82.

　　16 Rappa G，Finch RA，Sartrelli AC,et al.New insights into the biology and pharmacology of the multidrug resistance protein (MRP) from gene knockout models〔J〕.Biochem Pharmacol，1999;58:572-82.

　　17 许冬梅，张源潮，杨清锐.多药耐药基因敲除小鼠结肠炎的免疫病理改变〔J〕.中华消化杂志，2005;25(2):71-4.

　　18 Gao Z,Fields GZ.Co-transfection of MDR1 and MRP anti-sense RNAs abolishes the drug resistance in multidrug-resistant human lung cancer cells〔J〕.Anticancer Res,1998;18(4c):3073.

　　19 Wang H，Chen XP，Qiu FZ.Overcoming multi-drug resistance by anti-MDR1 ribozyme〔J〕.World J Gastroenterol，2003;9(7):1444-9.

　　20 Takayama K，Nakanishi Y，Hara N.Gene therapy for lung cancer treatment〔J〕.Nippon Rinsho,2000;58(5):1048.

　　21 Galski H，Sullivan M，Willingham MC,et al.Expression of a human multidrug resR1) in the bone marrow of transgenic mice: resistance to daunomycin-induced leukopenia〔J〕.Mol Cell Biol，1989;9(10):4357-63.