蛋白酶体抑制剂DCI对胃癌细胞增殖的影响

　　作者：费正华，姜藻 作者单位：东南大学附属中大医院 肿瘤中心,江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的:探讨蛋白酶体抑制剂3，4二氯异香豆素(DCI )对人胃癌细胞系BGC823体外增殖和凋亡的影响。方法:将DCI加入BGC823胃癌细胞,采用MTT法检测细胞的生长抑制效应,Annexin Ⅴ/PI法及电镜观察DCI对细胞凋亡的诱导作用。结果:DCI可明显抑制BGC823细胞体外增殖,随着DIC浓度的增加和处理时间的延长,细胞凋亡率增加; 流式细胞术显示DCI可诱导胃癌细胞早期凋亡，细胞被阻滞在G1期;电镜观察发现,经DCI处理后的部分细胞具有凋亡细胞的典型形态特征。结论:DCI可抑制人胃癌BGC823细胞增殖并促进其凋亡。

　　【关键词】 蛋白酶体抑制剂;胃癌;细胞凋亡;细胞增殖

　　泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome pathway，UPP)是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一,包括细胞周期调节因子、转录激活和抑制因子、肿瘤抑制因子等[12]。蛋白酶体抑制剂能阻断UPP,抑制多种肿瘤的生长，目前该类药物硼替佐米已进入临床，MG132也在肝癌、直肠癌、肺癌等多系肿瘤细胞中得到广泛研究[35]。3，4二氯异香豆素(3，4dichloroisocoumarin,DCI )同样具有抑制蛋白酶体的功能，对肿瘤细胞也有抑制作用，本研究观察其对胃癌细胞生长增殖的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞与培养 人胃癌细胞BGC823购自上海细胞中心，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,在37℃、5%CO2培养箱中培养，使用时以0.25%胰蛋白酶消化。

　　1.1.2 试剂 DCI 购自Santa Cruz公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配成浓度为50 mmol·L-1的贮存液,4℃保存,用时稀释;四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品;RPMI 1640培养基购自Gibco公司;流式细胞仪为美国BD公司FACS calibur型号;酶标仪为BIORED 550型。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT法测细胞生长抑制效应 取对数生长期细胞接种于96 孔板,每孔5×103个细胞,孵育过夜后,实验组分别予终浓度为25、50、100、200、400、600、800 μmol·L-1 DCI,对照组予不含DCI的培养液,每组设3个复孔,各组分别培养6、12、24、48 h,用MTT法测每孔吸光度(A)值。

　　1.2.2 Annexin Ⅴ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布 实验组分别用终浓度为150、300 μmol·L-1 的DCI处理BGC823细胞,对照组予不含DCI的培养液,均继续培养24 h后收集细胞,用PBS洗2次,采用Annexin Ⅴ和PI荧光染色、流式细胞术定量分析细胞凋亡状况及周期分布。

　　1.2.3 细胞超微结构观察 收集经300μmol·L-1 的DCI处理24 h后的BGC823细胞及未经DCI处理的对照组细胞,戊二醛和锇酸双重固定,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色,透射电镜观察。

　　1.3 统计学处理数据用x-±s表示，应用SPSS 10.0软件Probit(概率单位法)计算，并行线性回归分析。

　　2 结果

　　2.1 DCI对胃癌细胞增殖的影响MTT法检测结果显示，100～800μmol·L-1的DCI对胃癌细胞均有抑制作用，见表1,12、24 h 的IC50 分别为478和398μmol·L–1。24 h回归方程为Y=-000104X±0.91476,其中Y、X 分别为细胞率和DCI的浓度。Y和X的相关系数r为0.98,P<0.01。

　　表1 MTT法检测DCI对胃癌细胞增殖的影响(略)

　　2.2 DCI对BGC823细胞周期分布和凋亡率的影响DCI作用于BGC823细胞24 h后收集细胞,用流式细胞术检测细胞周期,各个周期细胞百分比改变见图1。150和300μmol·L–1 浓度的DCI处理BGC823细胞,G0/G1期细胞增加,而G2和S/M期细胞明显减少(表2)。图2表示DCI作用24h后细胞的凋亡率。经流式细胞术检测，正常培养的BGC823细胞凋亡率为2.54%，而经150μmol·L–1DCI作用后,凋亡率已达18.27%,G1期前出现凋亡峰，DCI浓度为300μmol·L-1时,细胞凋亡率达23.86%,显示DCI诱导的BGC823细胞凋亡具有量效关系。

　　2.3 透射电镜观察结果对照组细胞体积大,细胞器丰富,染色质均匀(图3A)。经DCI作用后部分BGC823细胞出现细胞凋亡的形态学特征:细胞体积缩小,胞浆浓缩,细胞器减少,出现空泡，染色质固缩、边缘化,并形成凋亡小体(图3B)。

　　3 讨论

　　蛋白酶体抑制剂可有效地诱导恶性、增殖程度高的细胞凋亡,对正常细胞几乎无作用,从而成为治疗肿瘤的新途径[6]。DCI最初是作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，随后有多项研究显示DCI对UPP有明显抑制作用。早老素可以诱导Alzheimer病发生，其降解主要依靠蛋白酶体系统降解，蛋白酶体抑制MG132可以抑制早老素的降解，DCI也可以抑制其降解，但效率较MG132低，而同样作为广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂的AEBSF对早老素降解无作用[7]。DCI还可抑制泛素化的生长相关蛋白GAP43降解，主要是作用于20S蛋白酶体β亚单位N末端苏氨酸残基，抑制蛋白酶体的糜蛋白酶、胰蛋白酶样活性作用[89]。

　　A.对照组; B.BGC823细胞经150μmol·L–1 DCI作用24 h组; C.BGC823细胞经300μmol·L–1 DCI作用24 h组

　　图1 DCI作用于BGC823细胞后细胞DNA周期分布的改变(略)

　　表2 DCI作用于胃癌细胞24h各周期细胞所占比例 (略)

　　Drexler报道DCI在50μmol·L-1浓度时即可引起HL60细胞凋亡，对凋亡DNA片段的分析显示，DCI作用较硼替佐米强[10]。另有文献报道DCI可以使丝氨酸蛋白酶水平较高的纤维母细胞瘤L929细胞凋亡，凋亡与DCI和丝氨酸蛋白酶作用酰化的中间产物有关[11]。而DCI作为蛋白酶体抑制剂对其它实体瘤作用的研究，国内外鲜有报道。本试验将DCI作用于胃癌细胞后,细胞增殖明显受抑制,且呈剂量效应和时间效应关系,其中剂量关系较显著,r达0.98。当DCI浓度小于100 μmol·L-1时,细胞生存率减少不明显,400 μmol·L-1的DCI作用于细胞后,细胞凋亡率随时间延长逐渐增加。流式细胞术检测显示DCI可诱导肿瘤细胞早期凋亡,电镜也观察到典型的凋亡形态学改变,表明DCI可以有效地促进胃癌BGC823细胞发生凋亡,细胞被大量阻滞在G1期，S期和G2/M期细胞明显减少,这些可能是DCI抑制BGC823细胞增殖的机制之一。蛋白酶体抑制剂MG132作用于胃癌细胞后，同样观察到细胞生长受抑制，与剂量和作用时间相关，大量肿瘤细胞出现G2/M期阻滞，MG132诱导肿瘤细胞凋亡的机制已有较多的探讨[1213]，而DCI通过何途径对胃癌细胞增殖产生影响，尚待进一步研究。

　　A.对照组;B.BGC823细胞经150μmol·L–1 DCI作用24 h组;C.BGC823细胞经300μmol·L–1 DCI作用24 h组

　　图2 AnnexinⅤ/PI法测定DCI对BGC823细胞的诱导凋亡作用(略)

　　A.对照组; B.BGC823细胞经300μmol·L–1DCI作用24h

　　图3 DCI对BGC823细胞超微结构的影响 ×8000(略)

　　【参考文献】

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