Midkine mRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其临床意义

　　作者：胡俊,田小强,商延芳,刘飞,刘全俊,黄培林 作者单位：东南大学基础医学院 病理学与病理生理学系，江苏 南京210009

　　【摘要】 目的:探讨靶基因中期因子(MK)在食管鳞癌患者外周血中的表达及其与食管鳞癌生物学行为的关系。方法:采用巢式RTPCR方法检测54例食管鳞癌患者外周血的MK mRNA。10例正常健康志愿者外周血为阴性对照，11例食管鳞癌肿瘤组织为阳性对照。结果:54例食管鳞癌患者外周血MK mRNA阳性率为61.11%(33/54)，并与食管鳞癌患者淋巴结转移有显著相关性(P<0.05)，而健康成人外周血则无一例出现阳性。结论:应用巢式RTPCR方法检测食管癌患者外周血中的MK mRNA具有较高的敏感性和特异性，它有望成为判断食管鳞癌恶性程度、转移、复发和监测疗效的客观指标。

　　【关键词】 中期因子;食管鳞癌;外周血;肿瘤标志物;生物学行为

　　研究表明，恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就有癌细胞入血，即微转移(micrometastasis)，它是肿瘤的恶性标志和主要特征之一，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因之一。因此，早期诊断肿瘤微转移是提高恶性肿瘤治疗效果、改善患者预后的有效途径之一[12]。而巢式RTPCR可在1×107个单个核细胞中检出1～10个肿瘤细胞，其敏感性、特异性远高于其他方法[3]。迄今为止，国内外尚未见食管鳞癌患者外周血中期因子(midkine，MK)mRNA表达情况的研究报道。本研究拟用巢式RTPCR方法检测食管鳞癌患者外周血的MK mRNA表达，并探讨其与食管鳞癌生物学行为的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 样本 54例食管鳞癌患者均为东南大学附属中大医院胸外科2004~2006年的住院患者，所有病例均经病理确诊;男40例，女14例;年龄46～83岁，平均63.4岁。取术前患者外周血3ml。以11例食管鳞癌肿瘤组织标本为阳性对照，10例健康志愿者外周血为阴性对照。

　　1.1.2 试剂 淋巴细胞分离液和DEPC为南京生兴生物技术有限公司产品，Trizol试剂、RTPCR试剂盒及Taq酶等为日本TaKaRa公司产品。

　　1.1.3 引物 参照有关文献，采用Primer5引物设计软件自行设计，所有引物均由江苏百龙基因有限公司合成。引物序列见表1。

　　表1 βactin和MK基因的引物序列(略)

　　Tab1 Primer sequences of βactin and MK

　　1.2 方法

　　1.2.1 样本处理及总RNA提取 抽取术前患者外周静脉血3ml，以枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法常规分离单个核细胞。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。Trizol一步法分别提取总RNA20μl，将提取的RNA于紫外分光光度计上定量，并行10%琼脂糖凝胶电泳，以明确RNA未降解。

　　1.2.2 逆转录合成cDNA和PCR扩增 所有标本各取5μl RNA，70℃6min变性，根据TaKaRaRNA试剂盒进行cDNA第1链合成，行MK巢式PCR。第1轮PCR：取cDNA5.0μl，10×PCRbuffer2.5μl，25mmol·L-1MgCl20.5μl，10mmol·L-1dNTP0.5μl，10pmol·L-1第1轮PCR上、下游引物各2.5μl，TaqDNA聚合酶1.25U，加灭菌水至25μl。反应条件：94℃5min预变性;94℃30s，60℃30s，72℃60s，30个循环;72℃5min延伸。第2轮PCR：取第1轮PCR产物2.0μl作模板，加10pmol·L-1第2轮PCR上、下游引物各2.5μl，除退火温度改为53℃外，余反应体系及反应条件同前。选择βactin基因作为内参照质控指标。PCR反应中加入其上、下游引物各2.5μl，扩增条件除退火温度改为56℃外，余反应体系及反应条件同前，但只进行1轮扩增。

　　1.2.3 RTPCR产物鉴定 将第1轮PCR产物双向测序，并取第2轮MK PCR产物及βactinPCR产物各5μl加样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压80V，电泳约25min，然后用紫外光凝胶成像系统扫描并拍照。在相应位置(531、272bp)出现肉眼可见条带判为阳性(图1)。MK产物带272 bp，βactin产物带531bp

　　M.Marker;1.肿瘤组织阳性对照;2.健康捐献者外周血阴性对照;3～7.患者外周血

　　图1 3种标本PCR产物琼脂糖凝胶电泳示例(略)

　　Fig 1 Example of three kines of PCR products separated by gel electrophoresis

　　1.3 统计学处理用SPSS软件分析各组数据，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MK mRNA测序结果PCR产物采用上、下游引物进行双向测序，结果如下：5′ATGCAGCACCGAGGCTTCCTCCTCCTCACCCTC CTCGCCCTGCTGGCGCTCACCTCCGCGGTCGCCAAAAA　GAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCCGGGGAGCGAG　TGCGCTGAGTGGGCCTGGGGGCCCTGCACCCCCAGCAG　CAAGGATTGCGGCGTGGGTTTCCGCGAGGGCACCTGCG　GGGCCCAGACCCAGCGCATCCGGTGCAGGGTGCCCTGC　AACTGGAAGAAGGAGTTTGGAGCCGACTGCAAGTACAA　GTTTGAGAACTGGGGTGCGTGTGATGGGGGCACAGGCA　CCAAAGTCCGCCAAGGCACCCTGAAGAAGGCGCGCTAC　AATGCTCAGTGCCAGGAGACCATCCGCGTCACCAAGCC　CTGCACCCCCAAGACCAAAGCAAAGGCCAAAGCCAAG　AAAGGGAAGGGAAAGGACTAGACGCCAAGCCTGGAT3′。应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的BLAST分析软件，将第1轮PCR产物测序结果与从GenBank数据库获取这种MK基因的mRNA全长序列比对，结果完全一致。图2为部分测序结果。

　　2.2 食管鳞癌患者外周血中MK mRNA表达54例食管鳞癌患者外周血中MK mRNA的阳性率为61.11%(33/54)。阳性对照组11例食管鳞癌组织中MK mRNA表达率为81.82%(9/11);阴性对照组10例健康志愿者外周血MK mRNA则全部阴性表达。

　　图2 MK测序图(略)

　　Fig 2 Sequence map of MK

　　2.3 食管鳞癌患者外周血中MK mRNA表达与临床病理的相关性分析本实验将患者按性别、年龄、细胞分化、临床分期、有无淋巴结转移、浸润深度及有无远处转移进行分类列表，探讨MK基因表达改变。根据年龄分为≤60岁和>60岁两组;按病理形态将肿瘤分化程度分为高(分化良好)、中(分化中等)、低(低、未分化)3大类;临床分期根据美国癌症分期联合委员会(AJCC)的肿瘤分期法，即根据肿瘤波及的范围(原位、器官内、器官外、侵入邻近器官、远处转移)分为5期(0～Ⅳ期)，按0～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期两组讨论;浸润深度按传统TNM分期法分为T1～T2和T3～T4两栏进行比较。结果见表2。MK mRNA表达在有无淋巴结转移组之间存在差异(P<0.05)，而其它各组无明显差异(P>0.05)，提示食管鳞癌患者外周血中MK mRNA阳性表达与患者的性别、年龄、临床分期、细胞分化程度无明显相关，而与患者有无淋巴结转移有关。另外4例食管鳞癌术后复发患者和1例远处转移患者外周血中MK基因均为阳性(100%，5/5)。

　　表2 食管鳞癌患者外周血中MK mRNA表达情况与病理分型、分期的关系(略)

　　Tab 2 Relationship between expression of MK mRNA and pathologic type and stage of tumor

　　1)P<0.05

　　3 讨论

　　MK作为肝素结合生长因子家族的一员，是一种能被维甲酸诱导产生的生长因子，具有促神经轴突生长、组织修复和促进血管生长等作用。正常生理情况下，MK基因表达具有时间性和空间性的特征，并随个体的发育而变化，在胚胎期高表达，出生后逐渐降低，在成年组织中，除肾脏和小肠上皮外其它部位几乎不表达[45]。而不断有研究表明，MK在人类多种癌组织中出现高频率、高强度表达。到目前为止，仍不断有表达MK的新肿瘤病例的报道[56]。特别在婴幼儿最多见的恶性肿瘤之一Wilms肿瘤中，Adachi等[7]发现人MK基因启动子-157～-149区域有Wilms肿瘤抑制基因WT1的结合位点，正常情况下WT1与其结合，抑制MK基因表达，当WT1缺失，抑制作用被解除，这也是几乎所有Wilms肿瘤中均可见MK过表达的原因。在食管癌方面，王琼等[8]采用免疫组织化学染色方法检测的45例食管癌中，35例为阳性，表达率高达778%，并与肿瘤血管形成有关。本实验阳性对照组11例食管鳞癌肿瘤组织中9例MK mRNA表达阳性(8182%)的结果与之一致。Shimada等[9]还在检测血清中MK蛋白的浓度时发现，61%的食管鳞癌患者MK蛋白浓度明显升高，且与肿瘤的大小及预后相关。这些研究都说明，MK可能参与肿瘤形成，并有望成为一种新的肿瘤标志物。本研究应用巢式RTPCR方法检测54例食管鳞癌患者外周血的MK mRNA表达情况，其阳性率为61.11%(33/54)。将实验结果与食管鳞癌患者临床病理资料综合分析发现，MK基因的表达在有无淋巴结转移之间有显著差异(P<0.05)，提示食管鳞癌患者外周血中MK mRNA的表达可反映该肿瘤细胞具有较强的恶性生物学行为。另外，虽然本研究中收集食管鳞癌手术复发患者和远处转移患者外周血标本较少(5例)，但MK mRNA均为阳性(5/5)，而作为阴性对照的10例志愿者外周血MK mRNA均阴性表达。结果显示，食管鳞癌患者外周血中MK mRNA阳性表达可提示肿瘤细胞具有较强的侵袭甚至转移的能力。目前，对MK基因的研究还处于初级阶段，它最终的生理和病理作用还未完全清楚。本研究结果提示，食管鳞癌患者外周血中MK mRNA的表达有望成为判断食管鳞癌生物学行为恶性程度、转移、复发和监测疗效的客观指标，但在肿瘤发生发展过程中的作用机制尚需进一步探讨。

　　【参考文献】

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　　[2]HUANG P，WANG J，GUO Y，et al.Molecular detection of disseminated tumor cells in the peripheral blood in patients with gastrointestinal cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(3):192198.

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　　[7]ADACHI Y，MATSUBARS S，PEDRAZA C，et al.Midkine as a novel target gene for the Wilms tumor suppressor gene(WT1)[J].Oncogene,1996,13(10): 21972203.

　　[8]王琼,赵永年,刘钧,等.MK在食管鳞癌中的表达及其与微血管密度的关系[J].肿瘤防治研究,2006,33(1):1516.

　　[9]SHIMADA H，NABEYA Y，TAGAWA M，et al.Preoperative serum MK concentration is a prognostic marker for esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Sci,2003,94(7):628632.