恶性肿瘤患者循环血DNA的研究进展

　　作者：邓立春 作者单位：东南大学医学院附属江阴医院 肿瘤血液中心，江苏 江阴 214431

　　【关键词】 循环DNA 肿瘤 肿瘤标志物 综述

　　循环DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液(血清或血浆)、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。早在1947年Mandel和Metais就发现了循环核酸;30年后Leon等人的研究表明肿瘤患者外周血清DNA水平大大高于正常人;1989年Stroun等发现血液游离DNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征;5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到了癌基因突变，并且与原发肿瘤相一致。随着肿瘤分子生物学研究的进展，循环血游离DNA的检测及其生物学指标的研究，将有可能为临床肿瘤的早期诊断、预后判断及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创和分子生物学检测手段。

　　1 恶性肿瘤循环血DNA的来源

　　正常人循环血中存在少量游离DNA，主要来源于细胞核DNA和线粒体DNA，常小于10 ng·ml-1;肿瘤患者循环血DNA主要来源于肿瘤细胞，其血浆DNA浓度平均可达180 ng·ml-1。Shapiro等[1]检测了386例消化道疾病患者血清DNA水平，发现肿瘤患者、良性疾病患者、正常人的血浆DNA水平平均分别为(412±63)、(118±14)和(14±3) μg·L-1，3组间差异有明显统计学意义。屠红等[2]检测了483例恶性肿瘤及150例健康人血清DNA水平，分别为(81.3±98.3)和(22.2±13.4) ng·ml-1，两者间差异有显著性。

　　目前，关于恶性肿瘤患者循环血DNA的来源及其发生机制有以下几种假说：(1)肿瘤细胞不断释放DNA进入血液循环。淋巴细胞或离体培养的器官能通过一种自我平衡的机制自发释放核蛋白复合物，并优先释放细胞内新合成的DNA。因此，有人推测肿瘤循环DNA可能以同样的方式释放入血。越来越多的研究[3]表明，肿瘤在生长过程中能持续自发释放肿瘤细胞DNA进入外周血液，成为循环血DNA的主要来源。(2)循环中肿瘤细胞或微转移灶的裂解。最常见的假说认为肿瘤患者血浆中的DNA主要来源于循环肿瘤细胞或者微转移灶细胞的裂解，但外周血中显然没有足够的肿瘤细胞能产生如此高水平的血浆DNA。研究发现，血浆DNA与一种18个赖氨酸的多肽结合成复合体，从而保持DNA在血浆中结构和功能的稳定性，并且可能是DNA非病毒传递系统中的一种主要传递方式。(3)肿瘤细胞的坏死或凋亡。因为在具有较多坏死组织的大肿瘤或进展期伴转移的晚期患者的血浆中发现较高水平的血浆DNA，从而推测血浆DNA可能来自肿瘤细胞的坏死。但是，在肿瘤早期也能在血浆中检测到DNA水平的升高[4]，说明肿瘤细胞的坏死可能不是循环血DNA的主要来源。由于血浆DNA电泳后可表现出凋亡细胞所特有的典型“梯型”条带[5]，因此，也有研究认为凋亡也是循环DNA的来源。另外肿瘤细胞侵袭周围细胞引起组织变性而释放DNA入血;淋巴细胞在与肿瘤细胞相互作用时亦能够释放一定量的DNA。由此可见，肿瘤患者循环DNA的形成是多种途径共同作用的结果，其来源与生理和病理状态下细胞代谢过程密不可分。

　　2 肿瘤相关的不同类型血清DNA改变

　　2.1 抑癌基因启动子的异常甲基化

　　DNA的甲基化是指生物体DNA在DNA甲基转移酶的催化下，以S腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程。其改变通过基因机制和表遗传学机制引起与细胞增殖和分化有关的基因表达异常，造成细胞失去对正常分化过程的控制而发生癌变，最后形成肿瘤。异常甲基化包括癌基因的低甲基化、抑癌基因的高甲基化、基因组不稳定性和基因印迹等几个方面，其中抑癌基因启动子的高甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制，在肿瘤发生发展中起重要作用。

　　甲基化特异性PCR(MSP)法是1996年发展起来的一种检测血浆DNA高甲基化方法，其原理是用硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，通过设计CpG岛的甲基化和非甲基化的特异引物各一对，进行特异性扩增即可将二者区分开来。LIU等[6]用MSP法检测不同癌症患者血清中p16基因甲基化，其中大肠癌患者血清中p16甲基化检出率早期为44%，晚期为54%。而肺癌、食管癌、乳腺癌和卵巢癌检出率分别为48%、50%、100%和40%。Zou等[7]在38%的大肠癌组织中检出了p16基因甲基化，血清中与之符合率达70%，而结肠腺瘤样息肉患者、健康者血清中都未检出p16甲基化，说明大肠癌患者组织和血清中p16甲基化改变的一致性。在肺癌方面，腺癌样结肠息肉病(APC)基因的高甲基化，被认为是生存较短的独立预后指标[8];APC基因高甲基化也作为食管腺癌发生的危险因素，比年龄或疾病临床分期更能预示患者的生存期和肿瘤复发[9]。对食管鳞状细胞癌，06鸟嘌呤甲基化DNA甲基转移酶(MGMT)启动子异常甲基化引起MGMT失活也是一个常见的分子事件，有研究[10]发现，正常食管组织中不存在MGMT甲基化，而食管癌中有38.7%存在MGMT甲基化。实际上高甲基化亦可以出现在正常的健康组织中，但血浆/血清DNA的高甲基化却只存在于纯恶性疾病中，因此其特异性诊断价值受到重视。不足之处在于这种检出率在某些癌中不高，且与疾病分期有关，因此限制了其早期诊断的价值。

　　2.2 微卫星改变

　　微卫星是指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，是一种普遍存在于人类基因组的重复序列，一般为2 6个碱基重复，位于相应表达基因的侧翼区或非编码区。同一患者的正常组织和肿瘤组织之间DNA微卫星体长度的差异提示在肿瘤组织中发生了突变，肿瘤细胞的微卫星改变是肿瘤发生、发展的重要事件，其主要形式有微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)，其发生与DNA错配修复系统有关。

　　微卫星MSI是指由于复制错误引起的简单重复序列的增加或丢失，表现为肿瘤组织与相应正常组织DNA结构性等位基因的大小发生改变。微卫星的LOH表现为与非肿瘤组织相比，肿瘤的一个等位基因丢失。如果某一肿瘤在某染色体上同一位点经常发生LOH，那么丢失的部位往往存在抑癌基因。恶性肿瘤患者微卫星改变主要发生在肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、黑色素瘤及头颈部癌等。Sozzi等[11]对Ⅰ Ⅲ期非小细胞肺癌患者血浆和肿瘤组织的DNA MSI和LOH进行检测，结果表明在56%的肿瘤组织和40%的血浆中能检测到微卫星改变，而阴性对照血浆中均无此改变;值得注意的是，43%的Ⅰ期患者以及45%的肺癌组织直径<2 cm的患者血浆中已出现微卫星改变。易斌等[12]检测了94例肺癌全血DNA 3p部位3个微卫星位点的LOH和MSI，阳性率达78.7%，在Ⅰ期，血浆游离DNA的MSI检测阳性率达65.2%。从而提示非小细胞肺癌患者血浆DNA微卫星改变发生于肺癌早期,并与肿瘤负荷(大小以及病理分期)无关。因此，检测循环血DNA微卫星改变可作为肺癌早期诊断及预后判断的一个特异性指标。在乳腺癌患者血浆中，Shaw等[13]也检测到微卫星变异，且与肿瘤分期及浸润性进展并无显著关联。然而，也有实验表明随着肿瘤临床分期的进展，血浆中DNA分子LOH的发生频率以及所累及的微卫星标志的数目都呈显著性升高。Taback等[14]对86例黑色素瘤病人血浆DNA进行了研究，结果Ⅰ期与Ⅱ期病人LOH频率为26%，而Ⅲ期与Ⅳ期则高达56%，提示血浆微卫星改变与疾病分期、进展及生存因素有关。最近，逄锦忠等[15]报道了肝细胞癌患者血浆循环DNA微卫星变异的检测结果，提示肝细胞癌血浆循环DNA发生LOH者占癌组织阳性病例的84.6%，发生MSI者占癌组织阳性病例的73.7%，血浆与原发灶微卫星变异的一致性达81.0%。

　　2.3 癌基因或抑癌基因的突变

　　癌基因正常情况下是以原癌基因形式存在，在抑癌基因作用下处于无致癌状态，当抑癌基因被破坏或突变或癌基因本身诱发突变，导致癌基因激活而诱发机体肿瘤的发生。循环血中最先检测到的与肿瘤相关的突变基因是ras基因和p53基因。Kras基因是p21蛋白质的编码基因，是人类肿瘤中最常见活化的原癌基因之一，在多种肿瘤中存在点突变，突变热点主要有3个，即密码子12、13、和61，尤其是12，这种异常以胰腺癌和结肠癌等发生率较高。在胰腺癌，Kras基因突变与肿瘤大小、分期及复发危险度明显相关，并可作为一个生存分析的独立预后指标[16]。在结肠癌，尽管与临床病理指标没有类似相关性，但由于Kras基因突变与肿瘤高危因素相关，因此可作为一个早期诊断的潜在指标[17]，然而多种肿瘤均可表现Kras基因突变，因此其检测的特异性受到限制;但其在鉴别非恶性疾病中却具有重要作用，虽然某些基因突变也可在健康和良性组织中检测到，但不会出现在血浆/血清中。

　　肿瘤抑制基因p53是迄今为止在人类癌症中最常突变的基因，且突变范围广(可从第4至第10外显子)，其功能缺失可导致细胞基因组不稳定并诱发肿瘤，也可阻断主要的凋亡途径，已在结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和头颈部癌患者血浆/血清DNA中检测到p53的点突变[1821]。

　　3 肿瘤患者循环血DNA的研究方法

　　循环DNA的检测分为定性和定量两种：前者主要检测血清或血浆中肿瘤特异性基因改变，包括基因突变、抑癌基因启动子高甲基化、MSI及LOH等。定量检测则以血循环DNA总量为指标，两者均可反映肿瘤的存在和严重程度。

　　血浆/血清DNA的定性分析通常是根据要进行分析的特异性基因片段进行特异性基因扩增，扩增产物通过凝胶电泳后行各种染色或显像，然后进行分析或基因测序分析。以PCR为基础的系列技术使血浆/血清DNA检测灵敏度达到10-7，检测更加有效、快速，如MSP法、逆转录PCR、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(RFLPPCR)、PCR与基因芯片技术相结合等。但从目前研究资料来看，循环血及组织中肿瘤标志性靶基因灵敏度和特异度都不理想，平均阳性率约50%;以PCR为基础的分子生物学技术，由于其检测的高灵敏度极易产生假阳性;又由于肿瘤的异质性，同一肿瘤可表达不同标志的DNA水平，有时也会产生假阴性。引进新的检测技术，采用多个靶基因联合检测等可进一步提高检测的灵敏度和特异度。

　　探索血循环DNA含量的检测方法，是定量研究循环DNA的关键步骤。早期研究方法有二苯胺法、溴化乙锭法、对流免疫电泳法和RNADNA杂交法等，它们均从不同角度研究DNA的含量及性状，但由于外周血中循环DNA含量极其微弱，已超出溴化乙锭染色等实验室常用的DNA定量方法的检测范围，其敏感度和特异度均较低。随着分子生物学技术的不断进步，涌现出了一系列基于分子生物学技术的研究方法，包括放射免疫法、分光光度测量法、DNA缺口平移标记技术、PCR核酸扩增技术以及Dipstick TM试剂盒等。由于放射免疫法涉及同位素，而荧光分光光度仪和Dipstick TM试剂盒价格昂贵，在很大程度上限制了我国此类研究的开展，有必要积极探索新的敏感、快捷、廉价的检测方法进行循环血DNA含量的研究。屠红等[2]利用染料SYBR greenⅠ能高度特异地与DNA结合并产生强烈荧光的特性，检测血循环双链DNA的含量，其敏感性较传统的溴化乙锭染色高出至少100倍以上，可检测0.5 500 ng·ml-1水平范围的血循环DNA浓度。邓立春等[22]采用镧系离子(Tb3+)探针荧光光谱法检测人外周血DNA荧光强度，恶性肿瘤外周血DNA荧光强度明显高于良性肿瘤及正常对照组，检测灵敏度和特异度分别可达69.0%和92.3%，该法具有经济、简易、敏感、重复性好、无放射性污染等优点。

　　4 循环血DNA检测的临床意义

　　循环血DNA作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用，尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。Sozzi等[4,11] 发现Ⅰ期肺癌患者循环血中即已存在DNA量及肿瘤相关DNA微卫星的改变;在对38例肺癌手术切除后进行随访的研究中发现35例无复发者术后6个月内血浆DNA平均水平降至34 ng·ml-1，显著低于其术前平均水平的345 ng·ml-1，而且血浆中特异性DNA微卫星改变也随之消失。然而，在术后血浆DNA出现2 20倍增加的3人中，2人术后2个月死于肝转移，1例2年后局部复发，说明循环DNA的量和性质改变与肿瘤的早期诊断和病情检测密切相关。Mulcahy等[23]检测了一组胰腺癌患者的血浆DNA Kras突变，阳性率达81%，其中4例初诊为胰腺炎的病人血清检出DNA Kras突变，在后来的5 14个月被诊断为胰腺癌，说明血清DNA具有肿瘤早期诊断的潜力。在乳腺癌，血循环DNA水平与临床分期、淋巴结转移及肿瘤大小具有相关性[24]。进一步研究表明，如血循环DNA水平持续升高说明肿瘤对治疗无反应，而在随访过程中水平持续下降说明患者仍处于缓解期[25]。

　　人们研究肿瘤循环血DNA，最终目的是希望找到一个简便而行之有效、经济而又不痛苦的检测方法。目前实验证据充分表明循环血中确实存在肿瘤特征性靶基因，这种靶基因和相应肿瘤组织中的基因表达高度一致，且与肿瘤的消减呈正相关，改变了过去作肿瘤基因检测只能用肿瘤组织来完成的状态，为肿瘤的诊断、治疗监控、预后判断和随访等研究提供了简便途径。由于循环DNA量的改变对于肿瘤的定位和定性诊断存在着较大困难，同时肿瘤细胞间歇性入血、肿瘤组织异质性以及检测技术、检测方法等原因，导致某些检测结果呈假阳性或假阴性，从而影响了肿瘤早期诊断的敏感性和有效性。如何将循环血DNA的检测应用于临床，还有待于认真评估循环DNA标记物的检测结果与大宗的、随机的、前瞻性的临床资料间的吻合程度。展望未来，肿瘤循环DNA的基础及临床研究必将成为受人瞩目的研究热点。

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