岩舒注射液对小鼠H22移植瘤p16表达及甲基化状态的影响

　　作者：张冠中 谢晓冬 盛辉 左云飞 作者单位：沈阳军区总医院肿瘤科，辽宁 沈阳 110016

　　【摘要】 目的 研究岩舒注射液对小鼠H22移植瘤的作用及其机制。方法 用小鼠H22移植瘤模型观察岩舒注射液的抗肿瘤作用，造模成功后分为岩舒注射液组和对照组，测定两组瘤重的差别;采用免疫组化法检测两组p16基因表达;采用限制性内切酶酶切﹑聚合酶链反应检测两组p16基因启动子区甲基化状态。结果 岩舒注射液组与对照组相比抑瘤率为59.49%，有显著差异(P<0.01)，p16蛋白表达增加 (P<0.01)，p16基因甲基化状态降低(P<0.01)。结论 岩舒注射液有抑瘤作用，增加p16蛋白表达，降低p16启动子区域甲基化水平可能是其主要的作用机制。

　　【关键词】 岩舒注射液;H22移植瘤;p16

　　岩舒注射液是由苦参、白茯苓等中药精制而成的纯中药制剂，临床研究显示其对多种肿瘤具有抑制作用〔1～3〕，在我们的临床观察中注意到其对于肝癌患者的作用尤其显著，但其作用机制不甚明了。p16基因表达的缺失或减少在肿瘤的发生和发展中起着极其重要的作用，其启动子区异常甲基化是影响其表达的重要分子机制之一〔4〕。为探讨岩舒注射作用的分子机制，本研究选用了BalB/C小鼠H22移植瘤为研究对象，观察该药物对于p16蛋白表达及其甲基化状态的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物与瘤株 BalB/C近交系小鼠20只，鼠龄6～8 w，鼠重18～22 g，雌雄各半。由本院实验动物中心提供。H22腹水型肝癌细胞株由大连医科大学微生物教研室提供。

　　1.1.2 药物及试剂 岩舒注射液为山西振东金晶药业有限公司产品。小鼠抗小鼠p16单克隆抗体(Santa Cruz公司生产),免疫组化检测SP试剂盒，辣根酶标记兔抗小鼠IgG抗体(Santa Cruz公司生产)购于北京中山生物技术有限公司，限制性内切酶HpaⅡ﹑MspⅠ、PCR试剂盒及随机引物购自大连宝生物有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物实验 将浓度为5×106的H22细胞0.1 ml/只接种于小鼠右腋中线距腋窝约2 cm处的皮下造成移植瘤模型。将20只荷瘤鼠随机分成两组，每组10只。从荷瘤次日起，岩舒注射液组小鼠每日3.6 ml/kg岩舒注射液腹腔注射〔5〕，对照组则以等量生理盐水腹腔注射。给药21 d后处死小鼠，剥离瘤组织称重备用。计算抑瘤率。

　　1.2.2 免疫组化方法检测p16蛋白表达 用链酶卵白素-生物素亲和法(SP法)检测岩舒注射液组和对照组各肿瘤标本p16蛋白的表达。取瘤组织用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋﹑切片，脱蜡后，按SP免疫组化试剂盒说明书操作，一抗为小鼠抗小鼠p16单克隆抗体，稀释度为1：200。以PBS代替一抗作为阴性对照。p16免疫组化结果判定按照染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;按照阳性细胞所占百分比计分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为10%～50%，3分为50%～75%，4分为>75%。计数5个100×的高倍镜视野，按细胞染色强度与阳性细胞所占百分比积分之乘积判断该标本的等级：0～3分为-，4～5分为+，6～9分为，10～12分为。

　　1.3 p16基因甲基化状态的分析

　　1.3.1 抽提DNA 酚-氯仿抽提法提取各标本的基因组DNA,-20℃保存备用。

　　1.3.2 限制性内切酶酶切 限制性内切酶 HpaⅡ与MspⅠ为同裂酶，二者均为甲基化敏感酶，均可切开CCGG序列。但当该序列甲基化为CmCGG时，则不被HpaⅡ所识别，HpaⅡ不能将其切开。而当该序列甲基化为mCCGG时，则不能被MspⅠ所识别，MspⅠ不能将其切开。将3份2 mg DNA，分别用于非酶切对照、HpaⅡ和MspⅠ酶切;以20 U/mg的酶量37℃过夜酶切，对照组以双蒸水代替内切酶。用酚-氯仿-异戊醇抽提2次，乙醇精制，干燥后溶于10 μl双蒸水中。

　　1.3.3 聚合酶链反应(PCR) p16启动子区的上游引物为：5'-GTC AAA GGG TGA CCA GGC AT-3'，下游引物为：5'-CCC AGT CGT GTG ACC AGT GG-3'，扩增片段为317 bp。扩增体系：2.5 U/100 μl Taq聚合酶，200 μmol/L dNTPs,各0.1 μmol/L上下游引物，100 ng/100 μl DNA模板和1× PCR缓冲液，总体积50 μl。反应条件：94℃预变性1 min，然后98℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共30个循环，最后72℃延伸5 min。

　　1.3.4 PCR产物分析 取8 μl反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳并照相，以GIS凝胶处理系统对凝胶条带进行灰度分析，得出灰度值，通过比较PCR产物量的多少，判断对照组和岩舒注射液组甲基化程度的差异。

　　1.4 统计学处理 以秩和检验进行p16蛋白表达水平的差异分析。采用t检验进行抑瘤率和甲基化程度的差异分析。

　　2 结果

　　2.1 岩舒注射液对小鼠H22转移瘤生长的影响 岩舒注射液组瘤重〔(1.28±0.18)g〕显著低于对照组〔(3.16±0.21)g〕，抑瘤率为59.49%(P<0.01)。

　　2.2 免疫组化染色检测p16蛋白表达 p16主要定位于细胞核呈棕褐色颗粒表达，p16在两组均呈阳性表达，岩舒注射液组p16蛋白表达增加(P<0.01，图1和表1)。

　　图1 两组荷瘤鼠肿瘤标本p16蛋白表达(SP×400)(略)

　　表1 两组荷瘤鼠肿瘤标本中p16蛋白表达比较(略)

　　与对照组比较：P<0.01

　　2.3 p16甲基化状态的检测 PCR扩增后电泳，出现317 bp的条带时，说明p16启动子中的CCGG序列存在甲基化。因为当p16启动子区域中的CCGG序列处于甲基化状态时,甲基化敏感性内切酶HpaⅡ和MspⅠ不能识别该序列并将其切开，所以PCR反应可以将p16启动子序列扩增出来,在电泳时即可出现317 bp条带。相反，不出现长度为317 bp的条带时，则说明该序列没有被甲基化。317 bp条带深浅程度不同也能说明甲基化程度的差异，条带越深说明甲基化的程度越深，反之相反。

　　1和4为未酶切的染色体DNA，2 和5 为HpaⅡ酶切的染色体 DNA，3 和 6 为MspⅠ酶切的染色体DNA，7为DL2000 marker

　　图2 两组荷瘤鼠肿瘤标本中p16基因启动区电泳结果(略)

　　取上述消化后的DNA进行PCR扩增，应用PCR技术检测岩舒注射液组和对照组移植瘤p16启动子区甲基化状态，不酶切的对照组和岩舒注射液组电泳条带强弱无变化，而经HpaⅡ和MspⅠ两种酶切后的结果均显示岩舒注射液组条带强度减弱(P<0.01，图2和表2)。

　　表2 两组荷瘤鼠肿瘤标本中p16基因PCR凝胶灰度分析结果(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01

　　3 讨论

　　肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，目前常用的治疗手段是在西医的手术和放化疗基础上，辅以中医中药治疗。中医认为肝癌是湿热淤毒蓄积体内所致，因此清热解毒是中医治疗肝癌最常用的方法之一。岩舒注射液的主要成分为苦参碱，是典型的清热解毒类抗肿瘤中药〔6〕。

　　肿瘤实际上是一类细胞周期病，G1→S关卡的失控与肿瘤的发生发展有着尤其密切的关系〔7〕。p16是该关卡细胞周期素D(cyclin D)-RB通道上极其重要的一个抑癌基因，它可与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期素依赖性激酶6(CDK6)特异性结合，竞争性抑制它们与Cyclin D的结合。Cyclin D-CDK4或cyclin D-CDK6复合物可使其下游的RB蛋白磷酸化，释放出转录活性因子E2F因子,使细胞周期得以向前发展〔4，8〕。在正常情况下，Cyclin D与p16处于动态平衡中，共同调节着细胞周期的进程。当p16蛋白含量减少时，Cyclin D-CDK4或6复合物的含量增加，结果将是细胞周期进程过度向前发展，细胞过度增殖，以致于癌变。由我们免疫组化的实验结果可以看出，应用岩舒注射液的转移瘤组织中p16蛋白的表达量较对照组有明显提高，p16蛋白的增加将对转移瘤组织细胞周期的进程有所控制，将有利于肿瘤细胞的逆转。p16蛋白表达量减少或缺失的机制包括基因的缺失﹑启动子区域CpG岛的异常甲基化和基因的突变。而且，人们已经发现在多种恶性肿瘤中p16的启动子区CpG岛的异常甲基化是该基因灭活的主要机制。CpG岛是指DNA序列中G+C的含量超过50%，CpG的实际值与预期值之比大于0.6的区域〔9〕。CpG岛多存在于管家基因和少量组织特异性基因的启动子区域,与基因调控有关。与其他部位的CpG不同，CpG岛中的CpG在正常细胞中是非甲基化的，非甲基化基因处于转录活动状态，而甲基化基因处于失转录状态。与基因缺失和突变不同，异常甲基化状态是可以逆转的〔10〕。用5氮-2脱氧胞苷治疗甲基化的细胞系可导致显著的p16启动子区甲基化程度降低和基因的再表达。在我们的实验中，应用岩舒注射液组小鼠的肝癌移植瘤p16的甲基化状态与盐水对照组相比明显减轻，这可能是p16表达增加的原因所在。但该药物使甲基化状态减轻的机制是否如5氮-2脱氧胞苷一样掺入DNA合成，降低DNA接受甲基化的能力或是还有其他的机制我们还不清楚。

　　岩舒注射液作为一个中药制剂，对于肝癌瘤细胞的作用可能是多方面的。本文研究了它对于细胞周期中的p16基因的表达和甲基化状态的影响。它对细胞周期中其他的调节蛋白的作用及其机制有待于进一步的研究。

　　【参考文献】

　　1 沈菊梅.岩舒注射液联合化疗治疗非小细胞肺癌的临床观察〔J〕.临床肺科杂志，2006;11(2)：182.

　　2 王婷婷,孙桂生,刘景荣.岩舒注射液加肝动脉化疗栓塞治疗肝癌36例〔J〕.山西医科大学学报，2005;36(1):82.

　　3 王凤玲,李雪丽.岩舒和顺铂联合治疗肺癌并发胸腔积液〔J〕.中国老年学杂志，2005;25(1)：102.

　　4 Laura J，Hardie S，Jane D,et al.P16 expression in Barrett′s esophagus and esophageal adenocarcinoma：association with genetic and epigenetic alterations〔J〕.J Cancer Letters，2005;(217):221-30.

　　5 熊玉兰,王彦礼,孙建辉,等.岩舒注射液对荷瘤小鼠化疗增效减毒及免疫功能的影响〔J〕.中国中医药信息杂志,2006;13(11):48-50.

　　6 焦顺昌，陆军章.表格式临床医学系列丛书〔M〕.北京:中国医药科技出版社，2003:142-9.

　　7 Chakravarti A，Desilvio M，Zhang M,et al.The prognostic value of p16 expression in locally advanced prostate cancer：a study based on RTOG 92-02〔J〕.J Radiation Oncology，2005;63 (2):17-8.

　　8 Mao TL，Seidman JD，Kurman，RJ,et al.Cyclin E and p16 immunoreactivity in epithelioid trophoblastic tumor-an aid in differential diagnosis〔J〕. J Ame J Surg Patho，2006;(30):1105-10.

　　9 Angela DV，Luisa P，Barbara B,et al.P16 INK4a promoter methylation and protein expression in breast fibroadenoma and carcinoma〔J〕.J Int J Cancer，2005;(114)：414-21.

　　10 Friedrich P，Christiane O，Volker W,et al.P16 INK4a promoter methylation and 9p21 allelic loss in colorectal carcinomas：relation with immunohistochemical p16 INK4a expression and with tumor budding〔J〕.J Human Pathology，2006;(37)：578-85.