胃癌患者外周血hTERT mRNA转录水平及临床意义
发表时间：2010-07-20 浏览次数：405次
作者：胡福军 凌志强 陈晓钟 余传定 作者单位：310022 浙江省肿瘤医院(胡福军 陈晓钟 余传定)
【摘要】 目的 研究胃癌患者外周血中hTERT mRNA的表达，探讨其作为胃癌肿瘤细胞标志物的可行性。方法 应用实时荧光定量RT-PCR技术检测96例原发性胃癌、50例胃溃疡和60例健康献血员血清中hTERT mRNA表达水平，并对阳性PCR产物进行克隆、测序。结果 胃癌组hTERT mRNA表达水平(12.78±0.97) copies/ml，显著高于良性胃溃疡组(0.93±0.23) copies/ml和健康对照组(0.29±0.17) copies/ml。多变量分析表明，hTERT表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤生长方式、肿瘤分化程度、淋巴管侵犯、静脉侵犯均无显著相关性(p>0.05)，而与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、pTNM分期及CEA有显著相关性(p<0.05)。结论 qRT-PCR具有快速、敏感和特异的特点。定量分析外周血hTERT mRNA转录水平可作为胃癌的肿瘤细胞标志物之一，用于早期诊断。
【关键词】 胃癌 肿瘤标志物 hTERT mRNA 实时荧光定量RT-PCR
【Abstract】 Objective To investigate the expression and clinical value of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA in the peripheral blood of patients with gastric carcinoma. Methods Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was applied to detect the expression of hTERT mRNA in 96 gastric cancer, 50 gastric ulcers, and 60 healthy individuals without known major disease. PCR product was cloned into PUC19 vector and sequenced. Results hTERT mRNA expression was higher in gastric cancer patients (12.78±0.97) than gastric ulcer (0.93±0.23)(p<0.001), and healthy individuals (0.29±0.17) (p<0.001), respectively. Multivariable analysis showed that hTERT mRNA expression had no significant differences in hTERT mRNA with patient’s age, gender, location, tumor size, tumor growth pattern, the degree of cell differentiation, lymphatic vessels encroachment and vein encroachment (p>0.05), but had a significant between hTERT mRNA expression level and the depth of tumor infiltration, lymph node metastasis, distant metastasis, TNM staging and CEA values in gastric cancer (p<0.05). Conclusion Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) is a rapid, sensitive and specific method to detect hTERT mRNA. And the hTERT mRNA in the peripheral blood may be a tumor marker of gastric cancer, which can be used for its early diagnosis.
【Key words】 Gastric cancer Tumor marker Hhuman telomerasereverse transcriptase mRNA hTERT mRNA Real-time fluorescence quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
胃癌在我国死亡率居恶性肿瘤之首位，但早期诊治的5年、10年生存率分别可达到95%和90%[1]。因此，寻找敏感而特异的肿瘤细胞标志物对胃癌的早期诊治具有重要意义。端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，可稳定维持染色体的功能，防止染色体DNA降解、末端融合，保护染色体结构基因，调节正常细胞生长。端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关[2]。端粒酶(TERT)是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，与细胞分裂及寿命控制有密切关系。端粒、TERT对临床肿瘤的诊断和预后判断有一定意义[2]。本研究，应用实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescence quantitative RT-PCR, qRT-PCR)技术检测胃癌患者外周血hTERT mRNA水平表达，探讨其作为胃癌肿瘤细胞标志物的可行性。
1 材料与方法
1.1 对象
2000年8月至2006年12月手术切除的胃癌组织标本96例，患者男58例，女38例，年龄31～78岁(中位年龄58.2岁)，术前均未接受放、化疗;胃溃疡手术标本50例，患者男31例，女19例，年龄37～71岁(中位年龄54.6岁);另取健康献血员60例，男30例，女30例，年龄20～49岁(中位年龄38.5岁)。所有检测对象(胃癌、胃溃疡患者治疗前)均于清晨空腹静脉采血10 ml，室温静置后分三步骤离心(1000g、10 mins→1500g、10mins→3000g、10mins)，获取无细胞血清并可避免淋巴细胞的直接干扰。血清液氮速冻后保存于-80℃冰箱中直到试验结束。
1.2 引物的设计与合成
根据GenBank提供的hTERT mRNA序列，利用Primer Premier 5.0设计引物，跨内含子序列。HTERT引物：(F) 5’-cggaagagtgtctggagcaa-3’，(R)5’-ggatgaagcggagtctgga-3’。GAPDH引物：(F)5’-cggagtcaacggatttggtcgtat，(R)5’-agccttctccatg gtggtgaagac-3’。
1.3 RNA提取与逆转录反应
Trizol(上海生工)“一步法”提取细胞总RNA,溶解于15 μl DEPC·H2O中。提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的质量。吸取1μg细胞总RNA，加入随机引物0.5 μg。65℃10min后移至冰浴，随后加入4μl 5×逆转录缓冲液，20U RNasin(40U/μl)，1μl 10mM 4×dNTP, 用DEPC·H2O补足至19μl, 混合均匀后,于70℃反应 5min,加入1μl MMLV反转录酶(40U/μl)，37℃反应1h后，95℃热灭活5 min，置 -20℃贮存备用。
1.4 qRT-PCR定量分析
用LC real time PCR仪(Roche Diagnostics)及TaqMan SYBR Green Ⅰ(Roche Laboratories)荧光法定量分析hTERT mRNA含量，用拷贝/ml表示，并用GAPDH正常化校正。每次试验对空白管、阴性对照和hTERT RNA 各设4个标准管，浓度分别为104copies/L、103copies/L、102copies/L、101 copies/L，根据hTERT RNA标准品建立的标准曲线，由软件自动计算出待测样本中hTERT RNA的准确含量。每次试验中，阴性对照的Ct值(循环阈值)不显示任何数值，阳性参考品的标准曲线的r值介于-0.98～-1。qRT-PCR程序：95℃10mins后，95℃10s→55℃10s→72℃5s扩增45个循环，65℃15s、slope=0.1℃/s进行溶解曲线分析，最后40℃30s结束反应。以溶解曲线、及阴、阳对照对比判断样品中hTERT mRNA扩增产物的特异性。同时PCR产物用含溴化乙锭的2%琼脂糖进行电泳，hTERT mRNA阳性者可见131bp，内对照GAPDH为308bp。
1.5 PCR产物纯化和克隆、测序
按照试剂盒(德国Qiagen公司产品)说明，割胶纯化PCR产物，克隆至PUC19(大连宝生物公司)载体，转入DH5a感受态细菌中，37℃摇菌后提取质粒并测序。用紫外分光光度法计算拷贝数，梯度稀释作为标本检测时的阳性标准品。
1.6 统计学方法
组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 qRT-PCR分析
96例胃癌患者血清样品中均检测到hTERT mRNA上调表达(96/96，100%);50例胃溃疡患者中19例(38.0%)检测到hTERT mRNA表达，在健康对照组中均无表达。胃癌组、胃溃疡组与对照组相比，差异分别有统计学意义(p<0.01);胃癌组与胃溃疡组之间同样差异有统计学意义(p<0.01)。
2.2 hTERT水平表达
胃溃疡患者hTERT低水平表达(0.05～3.64 copies/ml)，平均(0.93±0.23)copies/ml;胃癌组hTERT水平表达相差较大(1.88～128.37 copies/ml)，平均(12.78±0.97)copies/ml。胃癌组与胃溃疡组比较差异有统计学意义(p<0.01)。
2.3 质粒测序
质粒测序由上海申友生物技术公司完成，测序结果与Genbank 提供的序列一致。
2.4 多变量分析
hTERT mRND转录水平与胃癌临床生物学特征关系 见表1。 表1 hTERT mRNA转录水平与肿瘤临床生物学特征的关系临床参数(略)注：为<10组、10～100组分别与>100组比较
3 讨论
端粒是染色体末端DNA多个重复序列与特异性结合蛋白的复合体，端粒长度反映细胞分裂增生能力，其长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关：端粒酶通过延长端粒而促进细胞无限增殖，在多种恶性肿瘤中高表达，如肺癌、大肠癌、前列腺癌等[3，4]。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是一种核糖核蛋白酶，由端粒RNA和端粒酶蛋白组成的一种特殊逆转录酶，在激活端粒酶的过程中起限速作用，能以自身RNA为模板合成端粒序列以稳定端粒长度使细胞获得永生， 也是人类端粒酶的活性中心，其表达是端粒酶活化的必须前题[2～4]。
本资料96例胃癌患者hTERT均有表达，而50例胃溃疡患者中仅19例(38.0%)有表达，60例健康对照组中无一例有表达，说明hTERT基因表达异常可能激活端粒酶，使正常胃上皮细胞的端粒长度不再缩短，从而参与胃癌发生。其异常表达可能在胃癌形成中具有重要的作用[5]。
本资料血清hTERT mRNA与临床病理参数相关性分析表明，hTERT水平表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤生长方式、肿瘤分化程度、淋巴管侵犯及静脉侵犯均无显著相关性(p>0.05)，而与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、pTNM分期及CEA有显著相关性(p<0.05);特别是hTERT与CEA的正相关性，提示hTERT基因可作为CEA之外的另一项诊断和评估胃癌预后可靠的肿瘤标志物[6];本资料中PCR产物克隆后测序结果与Genbank提供的序列一致，表明qRT-PCR 技术具有较高的敏感性和特异性，可用于外周血中肿瘤细胞标志物的检测，用于早期胃癌的诊断。
【参考文献】
1 Kelsen DP. Systemic therapy for advanced gastric cancer: a review. Hematol Oncol Clin North Am， 2007，21(2):18～25.
2 Liedo SM, Garcia-Granero E, Das F, et al. Real time quantification in plasma of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA in patients with colorectal cancer. Colorectal Disease, 2004, 6:236～242.
3 Zinn RL, Pruitt K, Eguchi S, et al. hTERT is expressed in cancer cell lines despite promoter DNA methylation by preservation of unmethylated DNA and active chromatin around the transcription start site. Cancer Res， 2007，67(1):194～201.
4 Valenti MT, Dalle Carbonare L, Bertoldo F, et al. The effects on hTERT gene expression is an additional mechanism of amino-bisphosphonates in prostatic cancer cells. Eur J Pharmacol， 2008，580(1-2):36～42.
5 Tani N, Ichikawa D, Ikoma D, et al. Circulating cell-free mRNA in plasma as a tumor marker for patients with primary and recurrent gastric cancer. Anticancer Res, 2007，27(2):1207～1212.
6 Wang J, Yang Y, Xia HH, et al. Suppression of FHL2 expression induces cell differentiation and inhibits gastric and colon carcinogenesis. Gastroenterology， 2007，132(3):1066～1076.
