一种新CD44变异体（CD44v17）在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

　　作者：弓晋灵， 许文林， 李娟， 杨靖， 吴晓君， 陈巧云 作者单位：江苏大学附属人民医院中心实验室， 江苏 镇江 212002

　　【摘要】目的： 探讨一种新CD44变异体(CD44v17)在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法： 根据本实验室在MCF7/Adr中新发现的一种CD44剪切拼接变异体CD44v17(基因库NO.FJ216964)设计特异性引物，应用SYBR GreenⅠ荧光染料，采用实时PCR法检测了52例乳腺癌组织及相应癌旁组织CD44v17 mRNA的表达情况，根据标准曲线计算出CD44v17 mRNA的表达量,分析CD44v17 mRNA表达与乳腺癌临床生物学特性之间的关系。结果： 乳腺癌组织CD44v17 mRNA表达(3.10±1.12)明显高于相应癌旁正常组织(2.31±0.84)(P<0.01);乳腺癌淋巴结转移组(4.07±1.13)显著高于无淋巴结转移组(2.75±0.89)(P<0.01);肿瘤组织>5 cm组CD44v17 mRNA表达(4.18±0.95)明显高于肿瘤组织≤5 cm组(2.96±1.07)(P<0.05);髓样癌(5.27±0.30)显著高于导管内癌(3.28±1.08)和浸润性导管癌(2.92±1.04)(P<0.05)，导管内癌和浸润性导管癌CD44v17 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);乳腺癌临床Ⅲ期CD44v17 mRNA表达(4.18±0.92)明显高于Ⅰ期(2.73±0.97)，Ⅱ期(2.76±0.96)(P<0.05);乳腺癌CD44v17 mRNA表达与雌激素受体、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和cerbB2表达无明显相关性(P>0.05)。结论: CD44v17 mRNA在乳腺癌组织中高表达，在乳腺癌的发生发展中起重要作用，可能与乳腺癌的侵袭、转移及预后有关。

　　【关键词】 CD44v17; 实时荧光定量PCR; 乳腺癌

　　Expression of the new CD44 variant(CD44v17) and its clinical significance in breast cancer tissues

　　GONG Jinling， XU Wenlin， LI Juan， YANG Jing， WU Xiaojun， CHEN Qiaoyun

　　(Central Laboratory, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002, China)

　　[Abstract]Objective: To investigate the expression and clinical significance of the new CD44 variant(CD44v17) in breast cancer tissues. Methods： The specific primers of the new CD44 variant(CD44v17)(GeneBank NO.FJ216964) found in MCF7/Adr in our laboratory were designed. The expression of CD44v17 at mRNA levels in 52 cases of breast cancer tissues and corresponding normal tissues was detected with the SYBR GreenⅠreal time fluorescent quantitative PCR(qRTPCR) method according to standard curve of CD44v17 mRNA. The relationship between the CD44v17 mRNA expression and biological characteristic of breast cancer was evaluated. Results: The significant difference of the CD44v17 mRNA expression levels was found between the group of breast cancer tissues(3.10±1.12) and the control group(2.31±0.84)(P<0.01). In addition, The expression levels of CD44v17 mRNA in the group of lymph nodes metastasis(4.07±1.13) were higher than that without lymph nodes metastasis(2.75±0.89)(P<0.01);CD44v17 mRNA expression in the >5 cm group(4.18±0.95) was significantly higher than that in the ≤5 cm group(2.96±1.07)(P<0.05); CD44v17 mRNA expression in the carcinoma medulla group(5.27±0.30) was higher than in the intraductal carcinoma(3.28±1.08)and infitrating ductal carcinoma group(2.92±1.04)(P<0.05);but there was no significant difference in CD44v17 mRNA expression between the intraductal carcinoma and infitrating ductal carcinoma group(P>0.05). CD44v17 mRNA expression in Ⅲ clinical stage(4.18±0.92) was significantly higher than that in Ⅰ(2.73±0.97)or Ⅱ group(2.76±0.96)(P<0.05);however, CD44v17 mRNA expression and estrogen receptor(ER)，progesterone receptor(PR) or cerbB2 did not exist statistical significance(P>0.05). Conclusion: CD44v17 mRNA was over expressed in breast cancer. The expression of CD44v17 mRNA may play important roles in tumorigenesis and progression of breast cancer. The expression of CD44v17 mRNA may be correlated with invasion, metastasis and prognosis of breast cancer.

　　[Key words] CD44v17; real time fluorescent quantitative PCR; breast cancer

　　侵袭和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，在临床上为绝大多数肿瘤的致死因素。作为一类重要黏附分子的CD44参与肿瘤侵袭转移的整个过程并在其中起着重要的作用。本实验室在MCF7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体CD44v17(基因库NO.FJ216964)，实验证实CD44v17可以通过上调MMP2﹑MMP9表达水平，从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。为进一步了解CD44v17在乳腺癌组织中的表达, 探讨其在乳腺癌中的作用, 我们采用荧光定量PCR方法，通过构建PMD19TCD44v17标准质粒，建立标准曲线，对52例乳腺癌组织及其相应癌旁组织CD44v17基因的表达进行定量对比研究，分析其与乳腺癌生物学特性的相关性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 临床资料及标本

　　标本来源于我院2008年10月到2009年6月52例女性乳腺癌患者，年龄29～85岁，中位年龄46岁，所有病例术前未接受过局部放射治疗、化疗或内分泌治疗，且均为首次诊断乳腺癌。组织学分类参照乳腺癌的国内分类方法，全部病例均经术后病理学证实，其中导管内癌14例，浸润性导管癌36例，髓样癌2例。临床分期按照1997年国际抗癌联盟提出的乳腺癌TNM分期标准：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ期13例。发生腋淋巴结转移者14例。取材在手术标本离体30 min内进行，取材后0.5～1 h迅速放入液氮罐冻存备用。

　　1.1.2 主要试剂与仪器

　　Trizol(Invitrogen公司)，PMD19TA克隆试剂盒(TaKaRa公司)、逆转录试剂盒、RTPCR试剂(Fermentas公司)，SYBR GreenⅠ实时PCR 试剂盒(TaKaRa公司)，胶回收试剂盒(Axygen公司)，质粒小提试剂盒(Axygen公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计及合成

　　利用Primer 5.0软件根据基因库NO.FJ216964设计特异性荧光定量PCR引物,并由上海生物工程技术服务有限公司合成，CD44v17:上游 5′CCCTGCTACCAGACACTCA3′，下游5′ TGTTCACCAAATGCACCAT3′;扩增片段281 bp。

　　1.2.2 组织总RNA提取

　　取液氮中保存的乳腺癌组织约100 mg在研钵中加入液氮研磨至粉末状，加入1 ml Trizol，提取组织总RNA，逆转录cDNA。

　　1.2.3 PMD19TCD44v17基因重组质粒构建及标准品制备

　　以上述制备的cDNA为模板，利用PCR扩增CD44v17片段。选取下列扩增条件。①反应液：ddH2O 32.0 μl，10×缓冲液5.0 μl，MgCl2(25 mmol/L)4.0 μl，dNTP 1.0 μl，上下游引物(10 pmol/L)各2.0 μl，cDNA模板2.0 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)2.0 μl，总50 μl。②反应条件：95℃ 预变性5 min;94℃ 30 s， 58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环;72℃ 10 min。将上述扩增产物在含0.5 mg/L溴乙啶的2.0%琼脂糖凝胶中电泳分离，胶回收纯化，TA克隆，转化DH5α感受态，阳性筛选，阳性克隆菌株通过LB培养基扩增，抽提并纯化质粒，质粒PMD19TCD44v17经TaKaRa公司测序，结果正确。将含有目的基因的质粒用Eppendof Biophotometer测定浓度,根据公式计算质粒拷贝数,稀释成108～104拷贝/μl作为标准品于-20℃冰箱保存备用。

　　1.2.4 标准曲线的制备

　　将稀释成108～104拷贝/μl的标准品作为模板在定量PCR仪上进行扩增，制备标准曲线。①采用下列两步法扩增条件：95℃ 预变性30 s;95℃ 5 s， 58℃20 s，40个循环。②反应体系：SYBR Premix ExTaq 10 μl，ddH2O 7.8 μl，CD44v17上下游引物各0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，总20 μl。扩增结束后由仪器内置软件绘制标准曲线和熔解曲线。

　　1.2.5 MX3000P定量PCR仪检测组织CD44v17 mRNA表达

　　将标准品、标本cDNA、阴性对照及空白对照按照上述反应体系和反应条件同时进行扩增，根据标准曲线检测每个样本的CD44v17 mRNA表达量。

　　1.2.6 统计学分析

　　利用SPSS13.0软件进行统计分析。组织标本CD44v17 mRNA的检测结果呈非正态分布，将原始数据取以10为底的对数变换，所有数据以±s表示。乳腺癌组织及其相应癌旁组织CD44v17 mRNA比较用配对样本t检验，CD44v17 mRNA的表达与肿瘤的大小、组织学分类、临床分期、淋巴结转移、雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及cerbB2的比较采用两样本t检验，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 qRTPCR检测乳腺癌组织与相应癌旁组织CD44v17 mRNA的表达量

　　将PMD19TCD44v17阳性质粒以不同梯度浓度(108～104拷贝/μl)和样本cDNA为模板，进行定量PCR扩增，制备标准曲线，扩增曲线和熔解曲线。结果见图1。其中，标准曲线见图1a所示，相关系数r=0.997，斜率M为-3.149，截距为38.31, 扩增效率为107.8%。图1b显示不同浓度标准品和部分样本的定量PCR扩增结果，扩增动力学曲线为典型的S形，平台期汇于一条直线上，指数区明显。图1c为扩增产物的熔解曲线，只有单个熔解曲线峰，无非特异性扩增，表明扩增的特异性。乳腺癌组织中CD44v17 mRNA表达量为3.10±1.12;相应癌旁正常组织的表达量为2.31±0.84;经配对样本t检验(t=7.706)，乳腺癌组织的CD44v17 mRNA表达量明显高于相应癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 CD44v17 mRNA的表达与乳腺癌生物学特性的关系

　　乳腺癌肿瘤>5 cm组CD44v17 mRNA表达量明显高于乳腺癌肿瘤≤5 cm组(P<0.05);淋巴结转移组CD44v17 mRNA表达量明显高于淋巴结无转移组(P<0.01);髓样癌CD44v17 mRNA表达显著高于导管内癌和浸润性导管癌(P<0.05)，导管内癌和浸润性导管癌CD44v17 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);临床Ⅲ期CD44v17 mRNA表达明显高于Ⅰ，Ⅱ期(P<0.05)，临床Ⅰ期和Ⅱ期CD44v17 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);乳腺癌组织中CD44v17 mRNA的表达量与ER，PR及cerbB2的表达无明显相关性(表1)。表1 CD44v17 mRNA表达与乳腺癌临床生物学特性的关系(略)

　　3 讨论

　　远处脏器转移是乳腺癌的主要特征,可以手术的乳腺癌患者中有50%术后5年内发生转移[1]。肿瘤细胞的侵袭、浸润和转移影响肿瘤患者的治疗和预后。肿瘤细胞的黏附作用在肿瘤的侵袭和转移中起着极为重要的作用。黏附分子CD44是一组分布广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，可与透明质酸等配体结合，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的信号转导，调节多种细胞的生物学行为，包括黏附、迁移、增殖、分化及凋亡等[2]。人类CD44基因位于11号染色体短臂上,包含20个外显子，由于剪切方式的不同,其转录产物分为两种类型,即标准型CD44s和变异型CD44v。CD44s分布广泛,在正常人体内大量存在,主要在间质和造血源性细胞表达，介导淋巴细胞的活化、分化、回流、黏附等一系列过程[3]。CD44v主要在上皮源性细胞中表达，在肿瘤组织中表达增强，为肿瘤细胞的增殖、分化、转移和侵袭提供微环境[1]。研究表明在正常的组织中只表达CD44s，恶性肿瘤常表达CD44v，而且转移潜力越强的细胞株，其CD44v的表达率越高[4]。本试验结果表明，乳腺癌组织CD44v17 mRNA的表达量显著高于相应癌旁组织，提示CD44v17很可能是乳腺癌发生发展的一个重要分子事件。这与国内外文献报道的结果基本一致。

　　CD44与临床及病理生物学特征之间的关系报导不一。有研究认为,CD44表达与乳腺癌发生淋巴结转移有关[5]。一项关于头颈部鳞癌的研究表明,高表达CD44v3的HOC313细胞显示出具有依赖CD44的高度迁移特性,且体内转移部位的淋巴结也呈CD44v3过表达[6]，而有研究却认为CD44免疫组化检测结果与组织类型、淋巴结状态、肿瘤大小等临床病理参数无相关,而且与无病生存率和总生存率等预后无关[7]。我们对52例乳腺癌组织中CD44v17 mRNA检测结果表明，乳腺癌肿瘤>5 cm组CD44v17 mRNA表达量明显高于乳腺癌肿瘤≤5 cm组，淋巴结转移组CD44v17 mRNA的表达量显著高于淋巴结无转移组，说明CD44v17参与了乳腺癌的早期发生，为转移做好了准备，积极促进了乳腺癌的浸润和转移，但有个别病例组织标本CD44v17 mRNA的表达量很低却发生了远处腋窝淋巴结的转移，这也提示我们肿瘤的侵袭转移是一个多因素参与的极其复杂的过程，肿瘤细胞锚定黏附过程除了受黏附因子CD44v的调节，还受其他许多黏附因子的共同调节。有研究认为，CD44可促进乳腺癌淋巴转移,但不是促进乳腺癌淋巴转移的唯一因素，乳腺癌进展、转移中可能还存在其他的机制[5]。同时，本研究还发现恶性程度高的髓样癌CD44v17 mRNA表达显著高于恶性程度低的导管内癌和浸润性导管癌，提示CD44v17的表达与乳腺癌的恶性程度有一定的相关性。临床Ⅲ期CD44v17 mRNA表达明显高于Ⅰ，Ⅱ期。令晓玲等[8]研究发现CD44v6在乳腺癌组织中的表达与其分化程度和TNM分期显著相关,表达强度随着病期的进展而增强。Heider等[9]发现CD44v6可能与肿瘤病理相关，其高表达存在于大多数鳞癌和一定数量的腺癌中。这与我们的研究结果基本一致。以上结果均提示CD44v17 可能与乳腺癌的预后有关，可作为有效判断乳腺癌预后的因子。CD44v17的表达量与ER和PR的阳性表达以及cerbB2的表达无显著相关，与Tokue等[10]报道的相同。

　　目前，可应用于预测乳腺癌预后的因子较多，但尚缺乏特异指标，因而研究新的有价值的指标将有助于提高判断的准确性。CD44v17是由本实验室在MCF7/Adr中新发现的一种CD44剪切拼接变异体，其与乳腺癌多种临床病理指标关系的研究还未见报道，因此探讨CD44v17在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床生物学特性和预后的关系，有助于理解CD44v17在乳腺癌表达的意义，为更进一步地认识CD44在乳腺癌的分子诊断、靶向治疗上的应用前景，阐明乳腺癌发生、发展的分子生物学机制及评估乳腺癌生物学行为与预后提供了更科学的依据。

　　【参考文献】

　　[1]Ouhtit A, Abd Elmageed ZY, Abdraboh ME, et al. In vivo evidence for the role of CD44s in promoting breast cancer metastasis to the liver[J]. Am J Pathol,2007,171(6):2033-2039.

　　[2]Jose L, Todd DC, Mark V, et al. CD44 attenuatesmetastatic invasion during breast cancer progression[J]. Cancer Res, 2005,65(15):6755-7663.

　　[3]Auvinen P, Tammi R, TammiM, et al. Expression of CD44s, CD44v3 and CD44v6 in benign and malignant breast lesions: correlation and colocalization with hyaluronan[J]. Histopathology,2005,47(4):420-428.

　　[4]Van Hal NL, van Dongen GA, Stigtervan Walsum M, et al. Characterization of CD44v6 isoforms in headandneck squamouscell carcinoma1[J]. Int J Cancer,1999,82(6):837-845.

　　[5]Looi LM, Cheah PL, Zhao W, et al. CD44 expression and axillary lymph node metastasis in infill rating ductal carcinoma of the breast[J]. Malays J Pathol,2006,28(2):83-86.

　　[6]Wang SJ, Wreesmann VB, Bourguignon LY. Association of CD44v3containning isoforms with tumor cell growth，migration,matrix metall oproteinase expression, and lymph node metastasis in head and neck cancer[J].Head Neck,2007,29(6):550-558.

　　[7]Berner HS, Suo Z, Risberg B.et al. Clinicopathological associations of CD44 mRNA and protein expression in primary breast carcinomas[J]. Histopathology,2003,42(6):546-554.

　　[8]令晓玲，黎卫平.乳腺癌组织中Ecadherin和CD44V6及uPA的表达及意义[J]. 中华肿瘤防治杂志，2007，14(3):189-192.

　　[9]Heider KH, Kuthan H, Stehle G, et al. CD44v6：a target for antibodybased cancer therapy[J].Cancer Immunol Immunother,2004,53(7):567-579.

　　[10]Tokue Y, Mat sumura Y, Kat sumata N, et al. CD44 variant isoform expression and breast cancer prognosis[J]. Jpn