YB1表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

　　作者：杨靖， 许文林， 李娟， 弓晋灵， 吴晓君， 陈巧云， 王法春 作者单位：江苏大学附属人民医院中心实验室， 江苏 镇江 212002

　　【摘要】目的： 观察Y盒结合蛋白1(YB1)对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。方法： 通过脂质体介导的方法将YB1 shRNA重组载体转染入人类乳腺癌MCF7细胞，经G418筛选及克隆化培养后获得稳定转染株。运用RTPCR和蛋白质印迹方法检测MCF7细胞中YB1 mRNA和YB1蛋白的表达水平，运用划痕实验和Transwell小室法检测细胞运动、迁移和侵袭能力的变化，同时运用RTPCR和蛋白质印迹方法检测细胞中MMP2的表达水平，并用明胶酶谱法检测MMP2蛋白的活性。结果： 稳定转染YB1 shRNA的细胞中YB1的表达明显低于转染随机片段的细胞和未转染组细胞，且细胞的运动、迁移和侵袭能力以及MMP2的表达及活性也较后两组细胞明显下降。转染随机片段的细胞和未转染组细胞间无明显差异。结论: YB1 shRNA可以沉默乳腺癌MCF7细胞中YB1的表达，并降低细胞的迁移和侵袭能力以及MMP2的表达及活性。

　　【关键词】 Y盒结合蛋白1; MCF7; shRNA; 迁移和侵袭能力; MMP2

　　Effects of Ybox binding protein1(YB1) on invasiveness and　migration capability of breast cancer cells

　　YANG Jing, XU Wenlin, LI Juan, GONG Jinling, WU Xiaojun, CHEN Qiaoyun, WANG Fachun

　　(Central Laboratory, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002, China)

　　[Abstract]Objective: To study the effects of Ybox binding protein1(YB1) on the invasiveness and migration capability of breast cancer cells.Methods： The recombinant eukaryotic expression plasmid including YB1 shRNA was introduced into MCF7 cells by lipofectamine mediation and the cell line with stable expression of YB1 was obtained by G418 screening and colony culture. The expression levels of YB1 mRNA and protein were determined by RTPCR and Western blotting. The mobility, invasiveness and migration capability of cells were evaluated by using wound healing assay and Transwell chamber model in vitro while the expression levels of MMP2 mRNA and protein were determined by RTPCR and Western blotting, and the activity of MMP2 protein was detected by Gelatin Zymography. Results: The expression of YB1 in the cells transfected with YB1 shRNA was much less than the cells transfected with random fragment and the control group. The mobility, invasiveness, migration capability and the expression of MMP2 as well as the activity of MMP2 protein of the cells transfected with YB1 shRNA were much lower than the other two groups while the differences between the other two groups were not significant.Conclusion: The interference of YB1 with YB1 shRNA in breast cancer MCF7 cells can suppress the expression of YB1 and the invasiveness and migration capability of cells， and decrease the expression of MMP2 and the activity of MMP2 protein.

　　[Key words]Ybox binding protein1; MCF7; shRNA; invasiveness and migration capability; MMP2

　　Y盒结合蛋白1(Ybox binding protein1，YB1)是Y盒蛋白家族成员之一，广泛分布于原核与真核生物，它参与多种生命活动过程，研究发现YB1与人类恶性肿瘤关系非常密切，在部分类型的肿瘤中表达量偏高，已证实YB1异常表达的肿瘤类型有前列腺癌、乳腺癌、肺癌等[1]，尤其在前列腺癌[2]和乳腺癌[3]中，YB1的表达量随病情恶化而增加，这些证据表明YB1与这些恶性肿瘤的发生、发展呈高度相关性。目前的研究结果表明YB1与肿瘤细胞的增殖和耐药及相关基因的转录调节有关，而关于YB1与肿瘤细胞的迁移和侵袭的关系研究相对较少。本研究运用基因沉默的方法将YB1 shRNA质粒转染入乳腺癌MCF7细胞中，观察其对MCF7细胞中YB1的表达以及细胞迁移和侵袭能力的影响，从而为乳腺癌基因靶向治疗提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　人乳腺癌细胞株MCF7，购自南京凯基生物有限公司。培养于RPMI1640完全培养基，其中含10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，置于37℃，5%CO2恒温保湿培养箱内培养。

　　1.2 试剂和仪器

　　胎牛血清和小牛血清(杭州四季青公司)，RPMI1640培养液、G418、脂质体LIPOFECTAMINETM2000，TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，MMLV逆转录酶，TaqDNA聚合酶及其缓冲体系，dNTP，RNA逆转录酶及随机引物(Fermnent公司)，靶向YB1基因的shRNA质粒pGenesIL1.1/YBX11，pGenesIL1.1/YBX12，pGenesIL1.1/YBX13和对照质粒pGenesIL1.1/HK(本实验室保存)。YB1和MMP2及GAPDH基因的引物由上海生物工程公司保存。兔抗人GAPDH多克隆抗体及兔抗人MMP2多克隆抗体购自武汉博士德生物公司，兔抗人YB1多克隆抗体购自ABCAM公司。明胶酶谱法电泳分析试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。

　　1.3 基因转染及阳性细胞克隆的筛选

　　采用LIPOFECTAMINETM2000脂质体转染法转染，操作流程按照说明书进行。转染48 h后换含G418 400 μg/L的完全培养液抗性筛选2周，未转染组MCF7细胞全部死亡，转染pGenesIL1.1/YBX11，pGenesIL1.1/YBX12，pGenesIL1.1/YBX13和对照质粒pGenesIL1.1/HK组的细胞均有抗性细胞生长，分别命名为MCF7/Y1，MCF7/Y2，MCF7/Y3，MCF7/HK。

　　1.4 YB1，MMP2基因的检测

　　采取半定量反转录聚合酶链反应(RTPCR)法。应用TRIzol体系提取RNA，反转录合成cDNA，-20℃保存。YB1和MMP2及GAPDH基因的引物序列分别为：GAPDH，P1：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′;P2：5′GAAGATGGTGATGGGATTGC3′;YB1，P1：5′ACCACAGTATTCCAACCCTCCTG3′;P2：5′ATCTTCTTCATTGCCGTCCTCTC3′;MMP2， P1：5′GATAACCTGGATGCCGTCGTG3′;P2：5′CAGCCTAGCCAGTCGGATTTG3′。扩增产物长度：GAPDH为226 bp，YB1为190 bp，MMP2为137 bp。2%琼脂糖凝胶(含EB终浓度为0.5 μg/ml)电泳，凝胶成像仪扫描并定量，以GAPDH为内参照进行质控和标化。

　　1.5 YB1和MMP2蛋白的检测

　　采用蛋白质印迹法。取对YB1基因干扰效果最好的一组稳定转染细胞，命名为MCF7/YB1细胞。将未转染组细胞(MCF7)作为空白对照组，将转染质粒pGenesIL1.1/HK细胞(MCF7/HK)作为阴性对照组。取对数生长期MCF7，MCF7/HK和MCF7/YB1细胞各2×106个，用PBS洗1次，提取总蛋白，取蛋白样品加入2×SDS加样缓冲液，于100℃煮沸，10 min变性。加样后于聚丙烯酰胺凝胶电泳(积层胶为5%，分离胶为8%)分离蛋白，积层胶电压为80 V，分离胶电压为120 V，持续约2 h，采用转膜仪转膜，条件为80 mA电转移过夜，将蛋白转至硝酸纤维素膜。10%脱脂奶粉封闭，一抗(1∶200)，室温孵育3 h，二抗(1∶500)室温孵育1 h后，于分子成像系统扫描成像。

　　1.6 MMP2蛋白活性的检测

　　采用明胶酶谱法。取对数生长期无血清培养的MCF7，MCF7/HK和MCF7/YB1细胞，吸取上清，4℃10 000×g离心5 min，将上清分别移至干净的1.5 ml离心管中，置于-70℃保存待测。根据试剂盒说明书操作制胶和电泳，经复性、消化、染色和祛色后得到蓝色背景下的白色条带，并拍照。

　　1.7 稳定转染细胞株的体外划痕实验

　　取对数生长期的MCF7，MCF7/HK和MCF7/YB1细胞，每组分别以1×106个/孔接种于六孔板中，在单层细胞表面用100 μl移液器枪头垂直划痕，PBS液轻洗2次，除去所有的细胞碎片，在倒置显微镜下观察0，24和48 h后划痕中细胞的迁移情况，并拍照。

　　1.8 稳定转染细胞株的体外迁移实验

　　收集MCF7，MCF7/HK和MCF7/YB1细胞，0.25%胰酶消化，用1%胎牛血清RPMI1640培养基制备成105/ml的细胞悬液，取200 μl细胞悬液，接种至Transwell上室铺匀，在下室内加入10%胎牛血清RPMI1640培养基600 μl，常规培养24 h。取出Transwell小室，用棉签拭去上室聚碳酸酯膜表面的细胞，用PBS轻轻冲洗，晾干，甲醛固定，0.1%结晶紫染色，双蒸水冲洗去除多余结晶紫染液，晾干，普通光学显微镜下观察，每个滤膜随机选取5个100倍视野，计数穿膜细胞数，实验重复3次。

　　1.9 稳定转染细胞株的体外侵袭实验

　　采用不完全培养基RPMI1640将Matrigel稀释(1∶6)，加入至Transwell小室，100 μl/孔(低温条件下)，37℃放置1 h，Matrigel充分聚合后，Transwell下室加入1 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，平衡1 h。收集上述各组细胞，0.25%胰酶消化，用1%胎牛血清RPMI1640培养基制备成105/ml的细胞悬液，取200 μl细胞悬液，接种至Transwell上室铺匀，在下室内加入10%胎牛血清RPMI1640培养基600 μl，常规培养24 h，取出Transwell小室，用棉签拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，PBS轻轻冲洗，晾干，甲醛固定，0.1%结晶紫染色，双蒸水冲洗多余结晶紫染液，晾干，普通光学显微镜下观察，每个滤膜随机选取5个100倍视野，计数穿膜细胞数，实验重复3次。

　　1.10 统计学分析

　　计量资料以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS13.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,采用单因素方差分析进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 shRNA转染前后YB1 mRNA和蛋白表达的变化

　　结果显示，MCF7/Y1，MCF7/Y2和MCF7/Y3组细胞中YB1 mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组，并且MCF7/Y2组中YB1 mRNA的表达量明显低于MCF7/Y1和MCF7/Y3组，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。因此选用MCF7/Y2细胞株进行后续实验，命名为MCF7/YB1。而与MCF7和MCF7/HK组细胞相比，MCF7/YB1组细胞YB1蛋白表达亦明显减弱，见图2所示。

　　2.2 shRNA转染前后细胞运动、迁移和侵袭能力的变化

　　体外划痕实验结果显示，MCF7/YB1组细胞的运动速度明显慢于MCF7和MCF7/HK组细胞，接种48 h后,MCF7细胞和MCF7/HK细胞划痕已基本长满，而MCF7/YB1细胞划痕依然明显，见图3。

　　体外迁移和侵袭实验显示，MCF7和MCF7/HK组细胞的迁移和侵袭能力无明显差异，而MCF7/YB1组细胞的迁移和侵袭能力明显弱于阴性对照MCF7/HK和空白对照MCF7，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4，5。

　　2.3 shRNA转染前后MMP2 mRNA和蛋白表达的变化

　　结果显示，MCF7和MCF7/HK组细胞中无明显差异，而MCF7/YB1组细胞中MMP2 mRNA表达明显低于MCF7和MCF7/HK组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

　　而与MCF7和MCF7/HK相比，MCF7/YB1组细胞中MMP2蛋白表达亦明显减少，条带变细，见图7。

　　2.4 shRNA转染前后MMP2蛋白活性的变化

　　结果显示MCF7和MCF7/HK组细胞MMP2蛋白的活性无明显差异，而MCF7/YB1组细胞MMP2蛋白活性明显减弱，条带变细，见图8。

　　3 讨论

　　YB1基因定位于1p34，基因组DNA中有跨越19 000的8个外显子，它的1 500的mRNA可编码一个43 000的蛋白，一级结构为三个区域：可变的氨基末端，高度保守的核酸结合区域CSD和由四簇交替的酸碱性氨基酸组成的羧基末端。CSD是YB1的主要功能区，它可识别各种基因启动子区的反向CCAAT盒，特异性地与其结合，调节基因的转录。肿瘤组织标本的检测结果也发现，YB1在人类恶性肿瘤组织中出现过度表达，而在癌旁正常组织低表达甚至不表达[4]，并且这种过度表达与肿瘤的增殖、凋亡、耐药及预后密切相关。

　　最近有研究表明在鼠NIH3T3细胞中，YB1可以通过与AP2和p53形成复合体，随后结合到鼠MMP2基因的增强子RE1上激活MMP2的转录[5]。而在鼠的肾小球膜细胞中，YB1可以介导MMP2的转录[6]。在人类的Hela肿瘤细胞中，人们还研究发现了YB1可以通过AP1来调节MMP13的转录[7]。众所周知，肿瘤细胞外基质的降解是肿瘤侵袭和转移的关键步骤，基质的降解主要依靠蛋白水解酶的作用，而MMPs(基质金属蛋白酶)中的MMP2在肿瘤的侵袭和转移过程中起着关键的作用。由此我们推断YB1可能通过调节MMP2的表达来影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。

　　本研究中，在运用YB1 shRNA质粒转染MCF7细胞后，RTPCR和蛋白质印迹法检测结果显示YB1 mRNA和YB1蛋白表达明显受到抑制，且明显低于阴性对照组和空白对照组细胞。稳定转染YB1 shRNA的细胞运动、迁移和侵袭能力明显低于阴性对照组和空白对照组，而RTPCR和蛋白质印迹法的检测结果也显示稳定转染YB1 shRNA的细胞中MMP2 mRNA和MMP2蛋白表达明显低于其他两组细胞，且稳定转染YB1 shRNA的细胞中MMP2蛋白的活性也明显低于其他两组细胞。而阴性对照组和空白对照组间细胞的运动、迁移和侵袭能力、MMP2基因和蛋白的表达和活性无明显差异。这些结果表明，YB1 shRNA可以特异性地沉默MCF7细胞中YB1的表达，并降低MMP2的表达以及MMP2的活性，能有效地抑制肿瘤细胞的运动、迁移和侵袭。在本实验中还检测了MMP9基因，但是未能检测出，可能与细胞株有关。

　　总而言之，由本研究结果推测，YB1在乳腺癌的发生和发展中具有重要的意义，体外实验表明YB1与乳腺癌细胞的迁移和侵袭有密切的关系，在今后的实验中，我们将进一步进行体内实验来探讨YB1与肿瘤迁移和侵袭的关系，从而为以YB1基因作为靶点治疗乳腺癌提供一定的理论基础。

　　【参考文献】

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　　[3]Huang J, Tan PH, Li KB, et al. Ybox binding protein, YB1, as a marker of tumor aggressiveness and response to adjuvant chemotherapy in breast cancer[J]. Int J Oncol, 2005, 26(3): 607-613.

　　[4]Kotaro S, Kenji S, Toshihiro O, et al. Nuclear expression of the Ybox binding protein, YB1, as a novel marker of disease progression in nonsmall cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2001,7(10): 3151-3155.

　　[5]Matsumoto K, Abiko S, Ariga H. Transcription regulatory complex including YB1 controls expression of mouse matrix metalloproteinase2 gene in NIH3T3 cells[J]. Biol Pharm Bull, 2005, 28(8): 1500-1504.

　　[6]Mertens PR, Harendza S, Pollock AS, et al.Glomerular mesangial cellspecific transactivation of matrix metalloproteinase 2 transcription is mediated by YB1[J]. J Biol Chem, 1997, 272(36): 22905-22912.

　　[7]Samuel S, Beifuss KK, Bernstein LR. YB1 binds to the MMP13 promoter sequence and represses MMP13 transactivation via the AP1 site[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1769(9/10): 525-531.