5氟尿嘧啶对肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制的研究

　　作者：张德海 张 晴 张翠云 高振月 作者单位：滨州医学院 滨州市 256603

　　【摘要】 目的 研究5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌细胞生长的作用方式。方法 用不同浓度的5氟尿嘧啶处理体外培养的人肺癌A549细胞，应用MTT法、倒置相差显微镜和吖啶橙染色法分析检测A549细胞存活率的变化及细胞形态结构的变化。结果不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞，随着药物浓度的增加和处理时间的延长，细胞存活率明显下降;且低浓度使细胞呈铺展状态，细胞质内空泡增多，吖啶橙染色显示酸性膜泡增多，高浓度使细胞变圆，出现凋亡状态。结论 5氟尿嘧啶能明显抑制A549细胞的生长，低浓度诱导细胞发生自噬，高浓度引起细胞凋亡。

　　【关键词】 5氟尿嘧啶;肺癌;自噬;凋亡

　　Effects of 5fluorouracil on lung adenocarcinoma A549 cell growth inhibition mechanism

　　ZHANG Dehai ZHANG Qing ZHANG Cuiyun et al

　　Binzhou Medical University,Binzhou 256603

　　【Abstract】 Objective To study the inhibitive effect of 5fluorouracil on the growth of human lung carcinoma cells A549.Methods With different concentrations of 5fluorouracil in vitro processing of human lung cancer A549 cells,MTT assay,inverted microscope and acridine orange staining were used to determine cell viability and morphological changes.Results Using different concentrations of 5fluorouracil to deal with A549 cells, with the increase in drug concentration and treatment time,cell survival rate decreased significantly;and low concentration of 5fluorouracil induced the cell spread and increased vacuolization within the cytoplasm, acridine orange staining showed an increase in acidic vesicles,high concentration made the cell round and cell apoptosis.Conclusion 5fluorouracil inhibited the growth of A549 cells significantly,with autophagy by low concentrations and apoptosis by high concentrations.

　　【Key words】 5fluorouracil，lung cancer，autophagy，apoptosis

　　5氟尿嘧啶( 5fluorouracil, 5Fu)是临床上常见的抗肿瘤化疗药物，它可以抑制肿瘤细胞生长[1],常用于治疗结直肠癌、消化道癌、乳腺癌、绒毛膜上皮癌等多种恶性肿瘤。5Fu是一种嘧啶类似物,可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物，与DNA和RNA结合，从而干扰DNA和RNA的合成，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用，但其抑制肿瘤细胞生长的作用机制尚不清楚。近年来，国内外许多研究表明，5氟尿嘧啶抑制肿瘤细胞生长是通过诱导细实现的[2，3];而也有研究证明，5氟尿嘧啶能诱导细胞发生自噬[4]。本研究以人肺腺癌A549细胞为例，来探讨5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌A549细胞生长的作用机制，以期为临床治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人肺腺癌A549细胞，HAM′S/F12细胞培养液(美国GIBCOBRL公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(上海生工)，二甲基亚砜(Sigma公司)。5氟尿嘧啶(深圳万乐药业有限公司)用二甲基亚砜(DMSO)溶解。

　　1.2 细胞培养 A549肺癌细胞系在含10%胎牛血清的HAM′S/F12培养基中，置于37℃，5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养。每3 d半量换液传代，实验中选用对数生长期细胞。5Fu用DMSO溶解成1 mol/L储存液-20℃保存，使用前用细胞培养液稀释成所需浓度。

　　1.3 实验分组 根据加入的5氟尿嘧啶浓度不同将细胞分组：①对照组;②加药组(分别为5、10、20、40、80、100、200、300、400 μM)。将各组细胞接种到24孔和96孔板中，每孔细胞浓度为2×104/ml，置于37℃、5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养24 h后加药，分别于加药后24、48 h进行观察和分析。

　　1.4 细胞形态学观察 各组细胞加药24、48 h后，倒置相差显微镜下观察24、48 h细胞形态变化。

　　1.5 MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性 将上述培养于96孔板中的细胞根据实验分组加入不同浓度的5氟尿嘧啶，于各组药物处理终止前4 h每孔加入5 mg/ml MTT液20 μl，继续培养4 h，然后小心吸出各孔内培养液，加入100 μl DMSO，振荡至结晶全部溶解，酶标仪上570 nm测定光密度(OD值)。取各平行孔OD值的平均值,根据下式计算细胞相对存活率: 存活细胞% = (实验组OD 值/对照组OD 值)×100%(以不含细胞的培养液为空白组调零) 。

　　1.6 吖啶橙染色观察细胞质内酸性膜泡变化 上述培养于24孔板中的细胞用不同浓度的5氟尿嘧啶处理48 h后，将旧培养液吸出，PBS洗两遍，加入两滴0.1 mg/ml吖啶橙染液染色1 min，PBS洗两遍，于倒置荧光显微镜下观察结果。

　　1.7 统计学处理 实验数据以x±s表示,经重复测量资料的方差分析,P<0.05 表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 5氟尿嘧啶对A549细胞存活率的影响 用MTT法检测了5氟尿嘧啶对A549 细胞增殖的影响(表1)。用5、10、20、40、80、100、200、300、400 μM 的5氟尿嘧啶，分别处理A549 细胞24、48 h。数据显示，5氟尿嘧啶对A549细胞的影响表现出一定的浓度和时间依赖性关系。随药物处理时间的延长，细胞存活率降低;随药物浓度的增加，细胞存活率也表现出降低趋势。　表1 5Fu对A549细胞存活率的影注：单因素方差分析P<0.01，进一步两两比较(同一时间段

　　不同加药浓度组与对照组相比)P均小于0.01

　　2.2 5氟尿嘧啶对A549细胞形态学影响：A549 细胞经不同浓度的5氟尿嘧啶处理48 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化(图1)，发现10～100 μM处理组细胞质出现明显的空泡化，且10、20 μM 组空泡化现象尤其明显;300 μM处理组细胞出现明显的细胞凋亡特征;400 μM处理组除有凋亡外还出现了明显的细胞坏死现象。

　　2.3 吖啶橙染色观察细胞质变化 为了进一步明确5氟尿嘧啶处理A549细胞后引起的细胞质的变化，我们用吖啶橙染色来观察细胞质内酸性膜泡的变化。不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549 细胞48h后，吖啶橙染色结果发现(图2)，与对照组相比5氟尿嘧啶处理组细胞质内酸性膜泡均明显增多，且10、20 μM处理组尤为明显，这与形态观察结果一致。

　　3 讨论

　　目前，多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡 (apoptosis)、自噬性细胞死亡(autophagy)和坏死(necrosis)三种类型 [5，6]，其中凋亡和自噬性细胞死亡属于程序性细胞死亡(programmed cell death)，分别被称为Ⅰ型程序性细胞死亡和Ⅱ型程序性细胞死亡。多年来，人们对Ⅰ型程序性细胞死亡——细胞凋亡的形态学、参与分子及其调控机制的研究颇多，对其在抑制肿瘤细胞生长中的作用较为了解，而对Ⅱ型程序性细胞死亡——细胞自噬，了解较少。自噬是细胞内的物质成分被溶酶体降解的统称，它是真核细胞所特有的，负责长寿命蛋白和一些细胞器的降解再利用[7]，在生物体的发育、正常生理活动和许多疾病中发挥重要作用。近年来许多研究表明，自噬与肿瘤的关系非常密切，像凋亡一样，自噬在调节癌症的发生，发展和决定肿瘤细胞对抗癌治疗的反应等方面起着很重要的作用，然而，对这一作用，研究者们颇有争议，至今尚无定论。

　　本实验细胞存活率检测结果表明(表1)，用不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞24、48 h，细胞存活率均呈现浓度和时间的依赖性关系，说明5氟尿嘧啶具有抑制肺腺癌细胞生长的作用。形态学观察结果显示(图1)，随5氟尿嘧啶浓度的增高，细胞表现出不同的反应：低浓度(<200 μM)时，细胞呈铺展状态，细胞质内空泡增多;高浓度(≥300 μM)时，细胞变圆，出现凋亡现象。这一结果提示，5氟尿嘧啶抑制肺腺癌A549细胞生长的作用方式可能是低浓度时诱导细胞发生自噬、高浓度时引起细胞凋亡。细胞自噬可能是在应激条件下被激活，起到延缓细胞凋亡的作用。为了进一步证实5氟尿嘧啶低浓度时是否诱导了细胞自噬的发生，我们采用吖啶橙染色方法来观察自噬泡(autophagic vacuoles)是否存在。吖啶橙染色结果显示(图2)，不同浓度的5氟尿嘧啶处理细胞后，细胞质内的酸性膜泡增多，而且5氟尿嘧啶10、20 μM处理组细胞内酸性膜泡最多，随药物浓度的增高，细胞内酸性膜泡逐渐减少。近年来，用吖啶橙染色法来观察应激条件下细胞质内酸性膜泡的变化，已经成为一种常用的鉴别细胞自噬的方法[8]。因此，我们的实验结果表明，5氟尿嘧啶低浓度处理A549细胞时，诱导了细胞自噬的发生。

　　以往许多研究表明，5氟尿嘧啶抗肿瘤的机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，而如今临床治疗发现，5氟尿嘧啶的耐药性在治疗过程中已变得非常普遍，成为治疗失败的重要原因。最新有研究证明，5氟尿嘧啶能够诱导结肠癌细胞发生自噬[9]，提示自噬在5Fu治疗肿瘤的过程中有不可忽视的作用。我们上述研究也发现，低浓度的5氟尿嘧啶能诱导人肺腺癌A549细胞发生自噬，高浓度的5氟尿嘧啶能引起A549细胞凋亡甚至坏死。因此，探索肿瘤细胞自噬的机制，阻断自噬的发生，降低肿瘤耐药性，可能是降低药物毒性提高肿瘤治疗效率的新策略。

　　(致谢：感谢滨州医学院李尊岭老师馈赠人肺腺癌A549细胞。)

　　【参考文献】

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