2NBDG用于乳腺癌MDAMB231细胞荧光检测研究

　　作者：胡慧，单秀红， 朱伟， 钱晖， 许文荣， 王亚非 作者单位：江苏大学临床医学院，江苏 镇江 212001;江苏大学附属人民医院影像科， 江苏 镇江 212002;江苏大学基础医学与医学技术学院， 江苏 镇江212013

　　【摘要】目的： 评价荧光2N[7硝基苯2乙二酸，34羟氨基](2[N(7nitrobenz2oxa1，3diazol4yl)amino]，NBD)标记2脱氧葡萄糖(2deoxyglucose，2DG)即2NBDG，靶向探测高表达葡萄糖转运蛋白1(Glut1)的MDAMB231乳腺癌细胞可行性。 方法： 2NBDG分别孵育接种在6孔板里的人乳腺癌MDAMB231细胞1,10,20,40 min后，荧光显微镜观察并摄像;为了进行竞争性抑制,用D型葡萄糖预先孵育细胞30 min后再加入2NBDG孵育20 min，荧光显微镜观察并摄像。同时用流式细胞仪分析孵育不同时间及有无竞争抑制的细胞吸收2NBDG量的差异。结果： 荧光成像显示2NBDG积聚在 MDAMB231细胞膜和细胞质内，加入D型葡萄糖竞争抑制后，荧光信号显著减弱;流式细胞仪分析表明最初的1 min 2NBDG被肿瘤细胞迅速摄取(MDAMB231细胞自发荧光强度为2.66±0.09，2NBDG孵育1 min后荧光强度为4.04±0.18)，10 min时吸收持续增加(荧光强度为5.64±0.17)，20 min吸收最明显(荧光强度为25.10±0.57);加入D型葡萄糖竞争抑制后，细胞摄取2NBDG的荧光强度降低46%。结论: 2NBDG能迅速被高表达Glut1的MDAMB231乳腺癌细胞靶向吸收，有望成为葡萄糖代谢的光学标记物来检测高代谢的恶性肿瘤。

　　【关键词】 乳腺癌细胞; 2NBDG; 荧光成像; 流式细胞仪

　　Study on 2[N(7nitrobenz2oxa1，3diazol4yl)amino] 2deoxyglucose　used for fluorescence imaging in breast cancer MDAMB231 cells

　　HU Hui， SHAN Xiuhong， ZHU Wei， QIAN Hui， XU Wenrong， WANG Yafei

　　(School of Clinical Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001; Department of Medical Imaging, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013，China)

　　[Abstract]Objective: To assess the feasibility of 2deoxyglucose labeled with the fluorescence(2[N(7nitrobenz2oxa1，3diazol4yl)amino],NBD) which is 2NBDG, as a targeting probe for detecting breast cancer cells which highly expresses Glucose transporter1(Glut1). Methods： MDAMB 231 cells which were grown in 6well plates incubated by 2NBDG for 1 min,10 min,20 min and 40 min respectively,and the result were analyzed by fluorescence microscopy imaging. For competitive inhibition, the cells were preincubated by Dglucose for 30 minutes before adding 2NBDG incubated for 20 minutes, then the result were analyzed by fluorescence microscopy imaging.Also,the amount differences of absorption of 2NBDG among cells incubated for different time and with or without competitive inhibition compared by flow cytometry. Results: Fluorescence microscopy imaging displayed 2NBDG accumulated in MDAMB 231 cells membrane and cytoplasm, and the fluorescent signal markedly dropped as adding free D glucose for competitive inhibition. Flow cytometry analysis of 2NBDG uptake displayed rapid uptake for the first one minute(the Fluorescence background of MDAMB231 cells was 2.66±0.09, incubation with 2NBDG for 1 minute was 4.04±0.18), the absorption of 2NBDG incubation for 10 minutes continued to increasely(fluorescence intensity was 5.64±0.17), the most obvious absorption was incubation for 20 minutes(fluorescence intensity of 25.10±0.57),and addition of D glucose reduced the fluorescence intensity by 46%. Conclusion: The preliminary data clearly demonstrate 2NBDG was taken up and accumulated in breast cancer cells,and may be used as a optic probe for glucose uptake in hypermetabolism malignant cells.

　　[Key words]breast cancer cells;2NBDG; fluorescence imaging; flow cytometer

　　传统影像技术如CT、MRI、超声诊断恶性肿瘤主要是通过辨别肿瘤形态学的改变来实现的。众所周知，恶性肿瘤在发生形态学改变之前，细胞代谢已明显改变。Warburg[1]最早证明了糖酵解增加是大多数恶性肿瘤的一个典型特征，因此肿瘤细胞葡萄糖摄取明显增加[2,3]。恶性肿瘤细胞过表达葡萄糖转运体(glucose transporter，Glut)主要是Glut1，以满足葡萄糖代谢需要。18FFDG PET成像就是利用恶性肿瘤的这一特征，目前已广泛用于肿瘤的诊断、分期及疗效监测[4]。尽管放射性核素成像有高敏感性、定量、可监测疗效等诸多优点，但也存在低空间分辨率、高费用及辐射损伤等缺点。光学成像不涉及任何电离辐射，而且具有价廉及高分辨率的优点，目前已有用于小动物光学成像的设备，用于人体的光学成像设备也指日可待。以肿瘤细胞Glut1为靶点用2脱氧葡萄糖(2DG)荧光类似物探测肿瘤葡萄糖代谢的光学成像研究在国外报道较多[5-7]，国内尚未见报道。部分大城市报告乳腺癌占女性恶性肿瘤首位，早期诊断是提高乳腺癌患者生存率、改善其生活质量的关键。因此，本研究探索用2DG荧光类似物2NBDG孵育高表达Glut 1的乳腺癌MDAMB231细胞，并通过荧光显微镜及流式细胞仪观察分析2NBDG靶向乳腺癌MDAMB231细胞的效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料及仪器

　　人乳腺癌MDAMB231购自中科院上海细胞生物学研究所;DMEM细胞培养基购自Gibcol公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;2NBDG购自Invitrogen公司;流式细胞仪(FACS Calibur，BD 公司);荧光显微镜(TE300，Nikon公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 2NBDG孵育乳腺癌细胞后的荧光成像

　　1×105 MDAMB231细胞种在6孔板中培养48 h，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次， 100 μmol/L 2NBDG 37℃孵育1,10,20,40 min后冰PBS洗3次进行荧光显微镜观察、摄像。为了进行竞争性抑制，预先加入50 mmol/L D葡萄糖37℃孵育30 min，再加入100 μmol/L 2NBDG 37℃孵育20 min，冰PBS洗3次，进行荧光显微镜观察、摄像。各时间组及D葡萄糖抑制组实验样品数为3个，实验重复3次。

　　1.2.2 流式细胞仪定量检测乳腺癌细胞吸收2NBDG

　　1×105 MDAMB231细胞种在6孔板中培养48 h后PBS洗3次，100 μmol/L 2NBDG 37℃分别孵育MDAMB231细胞1,10,20 min，冰PBS洗3次。胰酶消化收集细胞，流式细胞仪检测。为了进行竞争性抑制，预先加入50 mmol/L D型葡萄糖37℃孵育MDAMB231细胞30 min后再加入100 μmol/L 2NBDG 37℃孵育20 min，冰PBS洗3次，胰酶消化收集细胞，流式细胞仪检测。各时间组及D葡萄糖抑制组实验样品数为3个，实验重复3次。

　　1.2.3 统计学分析

　　用SPSS 17.0 统计软件，乳腺癌细胞自发荧光强度及各时间组摄取2NBDG的平均荧光强度采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSDt检验;多组方差齐性检验用Levene法。2NBDG 孵育20 min组的平均荧光强度及加入D型葡萄糖竞争性抑制组的平均荧光强度数据采用两样本t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 乳腺癌MDAMB231细胞荧光显像

　　2NBDG孵育乳腺癌MDAMB231细胞20 min后，荧光成像显示强荧光信号，40 min后观察荧光信号略减弱;预先加入D型葡萄糖孵育30 min后，再用2NBDG孵育MDAMB231细胞20 min，荧光信号较单纯2NBDG孵育MDAMB231细胞20 min的荧光信号降低50%以上(t=53.033，P=0.000)。见图1。

　　2.2 流式细胞仪检测结果

　　2NBDG孵育不同时间多组比较，差异有统计学意义(F=2457.500，P=0.000)。经Levene检验，方差齐(W=2.532，P=0.106)。

　　MDAMB231细胞自发荧光强度为2.66±0.09，2NBDG孵育1 min后荧光强度为4.04±0.18，较空白MDAMB231细胞荧光强度增加，差异具有显著统计学意义(P=0.001);10 min荧光强度为5.64±0.17，较2NBDG孵育1 min细胞荧光强度增加，差异具有显著统计学意义(P=0.000);20 min荧光强度为25.10±0.57，吸收程度最显著(P=0.000);40 min荧光强度为16.70±0.43，较2NBDG孵育20 min细胞荧光强度减低(P=0.000)。预先加入D型葡萄糖进行竞争性抑制，2NBDG再孵育MDAMB231细胞20 min的荧光强度为13.56±0.38，较未加入D型葡萄糖的纯2NBDG孵育MDAMB231细胞20 min的荧光强度降低46%(t=29.149，P=0.005)，见图2。

　　3 讨论

　　大多数肿瘤细胞较正常细胞葡萄糖酵解代谢增加，葡萄糖转运体过度表达，主要是Glut1。以Glut1为靶点的肿瘤荧光成像是近年来研究的热点之一。2DG是天然D型葡萄糖的衍生物，同样是通过Glut1转运入细胞内。2DG及其类似物[8]首先被位于细胞膜的Glut1识别转运，然后被己糖激酶磷酸化成6磷酸形式。因为缺少2位的羟基团，2DG类似物的6磷酸形式不能进行进一步的代谢，滞留在细胞内，从而被相应的成像设备探测显影。国外研究者用近红外荧光物质标记2DG，如pyro2DG、Cy5.52DG、IRDye800CW2DG等探测体外培养的肿瘤细胞及载移植瘤裸鼠体内葡萄糖代谢，尽管观察到了良好的成像效果[6,7,9]，但肿瘤细胞摄取近红外荧光物质标记2DG的机制有待进一步研究。

　　2NBDG是2DG 的荧光类似物，即2′位置的氧原子被荧光基团NBD所取代,相对分子质量为342.26，激发波长为488 nm，发射波长为542 nm，能够被荧光显微镜及流式细胞仪探测。2NBDG最初用于正常哺乳动物细胞及非哺乳动物细胞葡萄糖流量的检测[10,11]，国内有研究者将2NBDG通过尾静脉注入小鼠体内，用来反映脑内葡萄糖代谢水平[12]。近年来有研究者报道2NBDG能被体外培养的恶性肿瘤细胞如肝癌HepG2、胶质瘤U87MG迅速摄取，且摄取的速率及程度高于非恶性细胞，能够被D型葡萄糖抑制，提示2NBDG可以作为探测恶性肿瘤的标记物[5,6]。

　　本实验结果表明在最初的1 min 2NBDG即被MDAMB231细胞迅速摄取(P=0.001)，10 min吸收持续上升(P=0.000)，20 min吸收最显著(P=0.000)，2NBDG被MDAMB231细胞摄取后滞留在胞质内。结果与体外培养的其他恶性肿瘤细胞摄取2NBDG的动力学性质一致[5,6]。此外，本研究用D型葡萄糖预先作用30 min后再加入2NBDG，乳腺癌MDAMB231摄取2NBDG降低了46%，说明存在Glut的竞争性抑制，与文献报道2NBDG在Escherichia coli细胞代谢成2NBDG6磷酸酶，并能够被D葡萄糖抑制的结果类似[12]，进一步证明了2NBDG具有葡萄糖转运蛋白/己糖激酶途径的靶向性。

　　另一方面，2NBDG在肿瘤细胞中蓄积或保持超过40 min，提示2NBDG可以作为肿瘤葡萄糖代谢光学标记物，用于诊断培养的肿瘤细胞、人或动物原位恶性皮肤癌、内窥镜诊断结直肠及食管肿瘤、活检标本恶性组织的诊断、实时指导外科手术、实时监测肿瘤化疗效果等[13,14]。

　　综上所述，基于恶性肿瘤高表达Glut1，用2DG的类似物作为探测恶性肿瘤葡萄糖代谢的探针，除了已广泛应用于临床的放射性类似物18FFDG外，荧光类似物也有望应用于临床，为肿瘤的诊断及治疗提供新的途径。

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