血管紧张素(17)对兔急性心肌梗死再灌注微血管内皮功能保护的实验研究

　　作者：冷秀玉，曾武涛，马 虹，王礼春，廖新学，何建桂 作者单位：中山大学附属第一医院心血管医学部心内科，中山大学心血管研究所，广州 510080

　　【摘要】 目的 探讨血管紧张素(17)[ Ang(17)]对急性心肌梗死再灌注时微血管内皮功能的保护作用。方法 选用健康新西兰雄性大白兔30只，体重2.5～3.0 kg，随机分成以下3组：1)假手术组，2)缺血再灌注(ischemiareperfusion， IR)对照组，3)Ang(17)治疗组，每组10只。Ang(17)治疗组经置入式微量泵持续颈静脉给予Ang(17) (25 μg·kg-1·h-1)3 d，假手术组和IR对照组经微量泵只给予等量的生理盐水。每组均在3 d预处理后，冠状动脉左前降支结扎2 h，再灌注2 h。测定缺血前、后和再灌注2 h时血中一氧化氮(nitric oxide, NO)水平，再灌注2 h时心肌一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性，血循环内皮细胞(CEC)计数，并采用氯化三苯四唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察心肌梗死范围。结果 (1)心肌缺血前各组对比，NO在Ang(17)治疗组已显著升高(P<0.01);心肌缺血后2 h时，各组NO均比缺血前显著降低(P<0.01)，但在Ang(17)治疗组比IR对照组显著增高(P<0.01);再灌注2 h后，各组NO水平均比缺血2 h时进一步降低，但在Ang(17)治疗组仍比IR对照组显著增高(P<0.01)。(2)再灌注后2 h，血循环内皮细胞计数(CEC)，IR对照组与假手术组相比显著增加[(15.82±8.16) 个/mm3vs.(4.26±1.52)个/mm3，P<0.01];而Ang(17)治疗组与IR对照组相比CEC显著降低[(7.78±3.82) 个/mm3 vs.(15.82±8.16)个/mm3，P<0.05]并与假手术组无显著差异。(3)心肌NOS活性，与假手术组相比，IR对照组和Ang(17)治疗组均降低，但在Ang(17)治疗组NOS活性比IR对照组明显增高(P<0.05)。(4)心肌梗死面积在IR对照组为(28.70±5.45)%，而Ang(17)治疗组[(15.46±4.32)%]与之相比则显著降低(P<0.01)。结论 Ang(17) 对急性心肌梗死再灌注微血管内皮功能具有保护作用。

　　【关键词】 血管紧张素(17), 急性心肌梗死,再灌注损伤; 内皮功能

　　Abstract：Objective To explore the role of Angiotensin(17)[Ang(17)] in protection of microvascular function after reperfused acute myocardial infarction(AMI). Methods Thirty healthy male New Zealand white rabbits were randomly divided into 3 groups: (1) Sham operation group; (2) Ischemiareperfusion group (IR group);(3) Ang(17) group. Intravenous infusion of Ang(17) (25 μg·kg-1·h-1, for Ang(17) group) or saline (for sham operation group and IR group) was given by minipump for 3 days. After 3 days of pretreatment, the left coronary artery in the rabbit was ligated for 2 h and loosed subsequently for another 2 h. The serum levels of nitric oxide (NO) were measured before AMI, 2 h after both AMI and reperfusion. The activity of myocardial nitric oxide synthase (NOS) and the number of circulating endothelial cells (CECs) were also determined in 2 h after reperfusion. Myocardial infarction area was measured by triphenyltetrazolium chloride (TTC) method. Results (1)The baseline level of NO was significantly higher in Ang(17) group than in other groups (all P<0.01). After 2 h AMI, NO level was significantly reduced in each group compared with their baseline (all P<0.01), but the level of NO was significantly higher in Ang(17) group than in IR group (P<0.01). After 2 h reperfusion, NO was further reduced compare with their values in 2 h AMI, but the level of NO was still significantly higher than in IR group (P<0.01); (2) After 2 h reperfusion, the number of CECs was significantly increased in IR group than in sham operation group (15.82±8.16/mm3 vs. 4.26±1.52/mm3, P<0.01). The number of CECs was significantly reduced in Ang(17) group than in IR group (7.78±3.82/mm3 vs. 15.82±8.16/mm3, P<0.05) and there was no statistic difference between in Ang(17) group and in sham operation group; (3) After 2 h reperfusion, the activity of myocardial NOS was significantly reduced in both Ang(17) group and IR group compared with sham operation group, but the activity of myocardial NOS was significantly increased in Ang(17) than in IR group (P<0.05); (4) Myocardial infarction area was smaller in Ang(17) than in IR group [(15.46±4.32)% vs. (28.70±5.45)%, P<0.01]. Conclusions Ang(17) can protect microvascular endothelial function after reperfused AMI.

　　Key words:Angiotensin(17); Acute myocardial infarction; Reperfusion injury; Endothelial function

　　血管紧张素(17)[ angiotensin(17),Ang(17)]是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的内源性拮抗因子，其对心血管系统具有多方面的保护和调节作用[1]。我们前期的研究表明其能抑制血管平滑肌细胞增殖、心肌细胞肥大以及对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[13]。而心肌缺血再灌注时，冠状动脉内皮细胞功能紊乱，由此导致的心肌微血管内皮细胞功能受损是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)冠状动脉再通后无心肌再灌注(无复流现象)和心肌缺血再灌注损伤重要机制之一[4,5]。本研究在兔急性心肌梗死(AMI)再灌注模型中，进一步观察Ang(17)对AMI冠状动脉再通后微血管内皮功能的影响，探讨Ang(17)在防止AMI再灌注损伤中的可能作用机制，以期为防治AMI再灌注损伤提供新的理论和方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物和材料

　　雄性新西兰大白兔，体重2.5～3.0 kg，由中山大学动物实验中心提供。Ang(17)购于Sigma公司，渗透性微量泵购于美国ALZET公司，一氧化碳(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒购于南京建成生物研究所。

　　1.2 动物分组

　　选用健康雄性新西兰大白兔30只，体重2.5～3.0 kg，随机分成以下3组：(1)假手术组：每天经微量泵给予等量的生理盐水;(2)IR对照组：每天经微量泵给予等量的生理盐水;(3)Ang(17)组：将Ang(17)溶于2 ml生理盐水后放入微量泵，置入颈部皮下，并经颈静脉插管持续静脉给药3 d，给药剂量25 μg·kg-1·h-1。每组均在3 d预处理后再行AMI(结扎左冠2 h)再灌注(2 h)，其中假手术组冠状动脉左前降支下穿线不结扎。

　　1.3 AMI再灌注动物模型的制备

　　参照Miura等[6]的方法，兔以氯胺酮(100 mg/kg)耳缘静脉麻醉，右颈总动脉、右颈外静脉置管。气管插管人工呼吸机辅助呼吸，心电监护，经胸骨左缘第四肋间开胸，于冠状动脉左前降支近第一分支处穿引3号丝线结扎2 h，再放松2 h，建立AMI再灌注动物模型。模型成功标准为结扎时供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫，心电图示ST段弓背向上抬高大于0.5 mV，局部心肌变成紫红色并有节段性运动不良，松开结扎后STT下降1/2以上，局部心肌变红，为缺血再灌注模型成功。

　　1.4 血管内皮功能指标的检测

　　缺血前、后2 h和再灌注2 h采右心房血测定(1)血清NO水平：采用硝酸还原酶法，试剂盒由南京建成生物研究所提供，检测按试剂盒说明书操作;(2)血循环内皮细胞(CEC)的测定：用Percoll密度梯度法：静脉血1.5 ml置3.8%枸椽酸钠溶液0.4 ml的硅化玻管中，加于1 ml比重1.050 Percoll之上，1000 r/min离心20 min。分别取上层液体和中层(Percoll层)液体3000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀加0.5ml生理盐水充分混匀，用细胞计数板分别计上、中CEC数，同一标本重复计4次，取均值，上层和中层CEC数之和则为各标本的CEC数;(3)心肌NOS活性测定采用催化LArg法，试剂盒由南京建成生物研究所提供，检测按试剂盒说明书操作。

　　1.5 心肌梗死范围的测定[7]

　　采用TTC法：实验完毕后,将心脏取下,冰盐水洗,然后将心脏按短轴切面切成5 mm厚的切片,部分心肌片立刻置1%氯化三苯四唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)中37℃染色20 min。此方法可使梗死心肌不被染色,非梗死心肌染成砖红色，心肌梗死面积用Quantimet 500+图像分析系统测量各面积参数。图像分析仪测定心肌梗死及心室壁面积，并计算两者比值(%)。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS11.0统计软件包进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，同组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析及q检验，均以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Ang(17)对AMI再灌注时血NO水平影响

　　心肌缺血前各组对比，NO在Ang(17)治疗组已显著升高(P<0.01);心肌缺血后2 h时，各组NO均比缺血前显著降低(P<0.01)，但在Ang(17)治疗组比IR对照组显著增高(P<0.01);再灌注2 h后，各组NO均比缺血2 h时进一步降低，IR对照组降低水平达到统计学差异(P<0.05)，但在Ang(17)治疗组仍比IR对照组显著增高(P<0.01)。 提示Ang(17)能提高AMI和再灌注后的NO水平(表1)。

　　2.2 Ang(17)对AMI再灌注时CEC的影响

　　AMI再灌注后2 h， IR对照组CEC与假手术组相比显著增加[(15.82±8.16)个/mm3 vs. (4.26±1.52)个/mm3，P<0.01];而Ang(17)治疗组与IR对照组相比CEC显著降低[(7.78±3.82) vs.(15.82±8.16)个/mm3，P<0.05]，与假手术组相比有轻度升高，但无显著差异。说明AMI再灌注时不仅有内皮细胞功能的损伤，而且还存在内皮细胞的破坏、脱落，而Ang(17)能明显减少AMI再灌注时微血管内皮细胞的破坏、脱落。

　　2.3 Ang(17)对AMI再灌注时心肌NOS活性的影响

　　AMI再灌注后2 h，心肌NOS活性与假手术组相比，IR对照组和Ang(17)治疗组均明显降低[假手术组(1.78±0.29)U/mgprot，IR对照组(1.18±0.18)U/mgprot，Ang(17)组(1.41±0.22) U/mgprot，P均<0.01]，但Ang(17)组降低的幅度相对较小，而且Ang(17)组NOS活性与IR对照组相比明显增高(P<0.05)。提示AMI再灌注时心肌NOS活性明显降低，Ang(17)能增加AMI再灌注时心肌NOS活性。

　　2.4 Ang(17)对AMI再灌注时心肌梗死面积的影响

　　AMI再灌注2 h，通过TTC法测定心肌梗死范围，结果显示心肌梗死面积在IR对照组为(28.70±5.45)%，而Ang(17)治疗组为(15.46±4.32)%，与前者相比则显著降低(P<0.01)。提示Ang(17)可能通过保护AMI缺血再灌注时微血管内皮细胞功能，从而减轻缺血再灌注损伤，最终导致心肌梗死面积的减少。

　　3 讨论

　　早期溶栓或经皮冠状动脉介入治疗(PCI)可使AMI患者梗死的相关冠状动脉再通，缩小梗死面积，改善心肌梗死的预后。然而，缺血心肌再灌注后一段时间内心肌损伤可加重，出现再灌注心律失常、心肌顿抑甚至心肌坏死等，使病情加重、恶化。冠状动脉内皮细胞能分泌多种生物活性物质，对维持冠状动脉循环起重要作用。在心肌缺血再灌注时，内皮细胞分泌血管松弛因子(如NO)障碍，而分泌血管收缩物质(如内皮素)增加，导致冠状动脉收缩、痉挛，血小板聚集，使冠状动脉血流障碍而加重心肌损伤。因此，冠状动脉微血管内皮功能受损在心肌缺血再灌注损伤中起着重要的作用。Ang(17)是AngⅡ的内源性拮抗因子，其对心血管系统具有多方面的保护和调节作用，包括改善血管内皮细胞功能[1]，如Loot等[8]在心肌梗死的大鼠模型上，发现Ang(17)不仅能延缓心梗后心衰的发生、发展，同时还能改善血管内皮功能。我们在腹主动脉缩窄高血压大鼠模型中，持续使用Ang(17)4周，结果显示Ang(17)也能改善高血压大鼠的血管内皮功能[9]。

　　本研究结果显示IR对照组AMI和再灌注后血清NO水平均显著降低，AMI再灌注后心肌NOS活性亦明显降低。以上结果提示AMI再灌注心肌梗死区心肌微血管内皮细胞功能严重受损，分泌NO减少，NOS活性受到抑制。而经Ang(17)预处理后能显著提高兔缺血前的血清NO水平，在AMI后2 h及再灌注2 h后，Ang(17)组血清NO水平虽均有明显降低，但较IR对照组仍显著增高(P<0.01);与假手术组相比，Ang(17)组心肌NOS活性虽有所降低，但比IR对照组明显增高(P<0.05)。提示Ang(17)对AMI再灌注时的微血管内皮细胞功能具有明显的保护作用。我们曾在离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，在灌注液中加入Ang(17)，结果显示Ang(17)灌注组再灌注期室性心律失常较对照组明显减少，且能预防再灌注表1 不同处理组对AMI再灌注时血清NO水平的影响注：与假手术组比较，aP<0.01;与同组缺血前比较， bP<0.01;与同时段IR对照组比较， cP<0.01;与缺血后2 h时比较， dP<0.05

　　期左室收缩压进一步下降，并有利于再灌注期冠状动脉流量的恢复，说明Ang(17)对心肌缺血再灌注损伤确有保护作用[3]。Ang(17)选择性受体拮抗剂A779、吲哚美辛及NOS抑制剂可阻断这种抗心律失常作用[10]。以上提示Ang(17)对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用可能与其改善冠状动脉内皮细胞功能，促进NO释放有关。

　　CEC是指损伤脱落在血液循环中的血管内皮细胞，为目前机体可以特异而直接地反映血管内皮细胞损伤的标志物，其数量的变化可反映活体血管内皮细胞损伤的程度。本研究显示AMI再灌注2 h后，IR对照组CEC明显增加，提示在发生缺血再灌注损伤时，不仅有血管内皮细胞功能的紊乱，而且存在血管内皮细胞不同程度的破坏、脱落。这种血管内皮细胞的破坏，可能与缺血再灌注损伤时，能量缺乏、钙超负荷、氧自由基大量生成及其引发的脂质过氧化反应有关[11]。Ang(17)治疗组与IR对照组相比CEC显著降低并与假手术组无显著差异，提示在缺血再灌注损伤发生时，Ang(17)还有保护血管内皮细胞，防止其受损脱落的作用。

　　本研究还显示AMI再灌注2 h后，通过TTC法测定心肌梗死范围，显示心肌梗死面积Ang(17)治疗组比IR对照组显著降低(P<0.01)。这可能与在AMI再灌注时，Ang(17)能增加心肌NOS活性，促进NO的释放，改善微血管内皮细胞功能，减轻了缺血再灌注损伤有关。由于缩小了心肌梗死面积，从而有利于改善AMI预后。

　　总之，本研究提示Ang(17)能增加心肌NOS活性，促进NO产生增多，减少内皮细胞的破坏、脱落，改善AMI缺血再灌注时微血管内皮细胞功能，有利于减少心肌梗死面积，这可能是其减轻缺血再灌注损伤的机制之一，为临床防治缺血再灌注损伤提供了新的方法和途径，值得进一步探讨。

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