P14ARF和PCNA在骨肉瘤中表达及其意义

　　作者：胡红光， 郭一川，刘存，徐国义，崔文丽 作者单位：新疆医科大学基础医学院病理解剖学教研室， 新疆乌鲁木齐830011

　　【摘要】 目的：探讨P14ARF 和增殖细胞核抗原( PCNA)在骨肉瘤中的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学SP法检测52例骨肉瘤中的P14ARF和PCNA表达,并以15例骨软骨瘤作为对照，与临床病理参数进行比较分析。结果：P14ARF在骨肉瘤的阳性表达率为26.9%(14/52) ,在骨软骨瘤为73.3%(11/15) ，差异有统计学意义(P<0.01) ;PCNA在骨肉瘤的阳性表达率为84.6%(44/52) ,在骨软骨瘤为13.3 % (2/15) ,差异亦有统计学意义(P< 0.01); P14ARF和PCNA在骨肉瘤的表达与患者年龄、性别、组织类型及民族均无相关性(P>0.05) 。结论： P14ARF和PCNA表达与骨肉瘤的发生、发展有关，其可作为诊断骨肉瘤及评价其预后的辅助指标。

　　【关键词】 骨肉瘤; 免疫组化; P14ARF; PCNA

　　The significance and expression of P14ARF and PCNA in osteosarcoma

　　HU Hongguang， GUO Yichuan， LIU Cun et al

　　Department of Pathology， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China

　　Abstract: Objective: To study the expression and significance of P14AR and PCNA in human osteosarcoma tissues. Methods: The expression of P14ARF proteion and PCNA in 52 cases of osteosarcoma and 15 cases of osteochondroma as control group were be detected by SP method and the significance were analyzed. Results: The positive rate of P14ARF　was　26.9% (14/52) in osteosarcoma group and 73.3%(11/15) in osteochondroma group. There was a prominent difference between them　(P<0.01). The positive expression rate of PCNA was 84.6% (44/52) in osteosarcoma group and 13.3% (2/15) in exostosis group. There was a difference between them (P<0.01). P14ARF and PCNA expression had no correlation with the age,　gender, tumor celltype and different ethnic in osteosarcoma (P>0.05). Conclusions: The expressions of P14ARF and PCNA play a role in the occurrence and progress of osteosarcoma. They could be used as diagnosis of osteosarcoma and also index in evaluating the prognosis of osteosarcoma.

　　Key words: osteosarcoma; immunohistochemistry; P14ARF; PCNA

　　骨肉瘤(osteosarcoma ,OS)是最常见的骨原发性恶性肿瘤,其发生、发展与多种因素有关。有关研究认为P14ARF与增殖细胞核抗原( PCNA)可作为骨肉瘤辅助诊断及判断分级和预后的指标[1,2]，研究P14ARF与PCNA在骨肉瘤中的表达，将有助于对骨肉瘤发病机制的阐明，为其诊断、预后和进一步治疗提供新途径。目前有关P14ARF和骨肉瘤关系研究的报道较少。本研究采用免疫组化SP法对P14ARF蛋白和PCNA在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达进行检测,分析其表达意义，现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1一般资料

　　选取新疆医科大学1990～2007年存档石蜡包埋骨肉瘤组织标本52例，男性28例，女性24例，年龄5～88岁，平均年龄20.9岁。汉族19例，维吾尔族29例，其他民族4例。组织类型：骨母细胞型39例，软骨母细胞型4例，纤维母细胞型3例，毛细血管扩张型4例，骨旁型1例，骨膜型1例。选取15例骨软骨瘤石蜡包埋组织标本作为对照组，男性12例，女性3例，年龄9～59岁,平均年龄18.9岁。所有病例均经临床、影像学、病理学确诊。

　　1.2试剂与方法

　　全部标本均经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。浓缩型P14ARF兔抗人多克隆抗体(RAB0532) 、抗兔SP超敏试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; 即用型鼠抗人PCNA单克隆抗体(ZM0213)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实验严格参照SP试剂盒所附程序进行，用已知P14ARF与PCNA阳性的骨肉瘤做阳性对照，PBS液代替第一抗体。

　　1.3结果判定

　　P14ARF以胞核和(或)胞浆呈棕黄色颗粒为阳性，PCNA以胞核呈棕黄色颗粒为阳性。随机观察10个高倍视野，并计数不少于100个肿瘤细胞的阳性细胞数，取其平均值为该病例的细胞阳性率，并据此对染色结果分级。无阳性细胞或阳性细胞数<10 %为阴性(-),阳性细胞数10%～30%为弱阳性(+),阳性细胞数30%～70%为中度阳性(++),阳性细胞数>70%为强阳性(+++) 。

　　1.4统计学处理

　　应用SPSS11. 0软件包进行统计学分析,采用χ2检验及Fisher确切概率法，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1P14ARF与PCNA在骨肉瘤及骨软骨瘤中的表达P14ARF表达阳性部位在骨肉瘤和骨软骨瘤的细胞核和(或)细胞浆,呈棕黄色颗粒; PCNA表达阳性部位在骨肉瘤和骨软骨瘤的细胞核,呈棕黄色颗粒。P14ARF在骨肉瘤与骨软骨瘤中的阳性表达率分别为26.9%、73.3%，差异有统计学意义(P<0.01);PCNA 在骨肉瘤与骨软骨瘤中的阳性表达率分别为84.6%、13.3%，差异亦有统计学意义(P<0.01) (表1 )。表1P14ARF和PCNA在骨肉瘤及骨软骨瘤中的表达(略)

　　2.2P14ARF和PCNA与年龄、族别及组织类型的关系P14ARF和PCNA在性别、年龄、民族及组织类型不同骨肉瘤患者间的病理参数表达差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2P14ARF和PCNA阳性表达与病理参数的关系(略)

　　3讨论

　　P14ARF是一种抑癌基因,是INK4(cyclindependent kinase 4 inhibitor)家族成员， P14ARF可通过P14ARFMDM2p53通路进行细胞周期的调节和细胞凋亡的诱导,具有负性调控细胞周期和抑制细胞异常增殖的作用。有关研究表明P14ARF基因及其表达蛋白的异常与人类多种肿瘤的发生发展有关[3]。另有研究已发现P14ARF在胶质瘤、乳腺癌和胰腺癌等恶性肿瘤表达下调，其失表达的机制主要是该基因缺失、变异和启动子甲基化等[4～6]。Korshunov等[7]报道103例颅内室鼓膜瘤中P14ARF表达明显下降,认为与该瘤的生物学行为和病理分级相关。Watanabe等[8]发现P14ARF在子宫内膜癌中的表达比正常和增生的子宫内膜要高,认为P14ARF的表达与组织学分级有关。P14ARF是INK4a/ARF(inhibitor of cyclindependent kinase4aalternative reading frame)基因位点的表达产物。最近研究证实,ARF作为监督G1～S期细胞增殖的关键卡点，在抑制恶性骨肿瘤的形成中也发挥重要作用[9]。原向伟等[1]用免疫组化的方法检测30例骨肉瘤标本，结果显示P14ARF的阳性率为43.3%,认为P14ARF可作为骨肉瘤辅助诊断以及骨肉瘤恶性程度和病理分级的指标。本研究结果显示P14ARF在骨肉瘤的阳性表达率为26.9%,明显低于骨软骨瘤(73.3%)的表达，表明P14ARF对细胞周期的负性调节作用失控，从而导致细胞恶性增殖。其与骨肉瘤密切相关,在骨肉瘤发生、调节细胞周期方面具有重要作用，提示P14ARF可作为诊断骨肉瘤的辅助指标。PCNA与DNA的复制、细胞增殖及细胞周期调控密切相关，常作为测定细胞增殖水平的指标，其在细胞核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关[10] 。其在正常组织和瘤组织中均存在,但肿瘤组织中含量高[11]。Sui等[12]报道103例上皮性卵巢肿瘤发现survivin与标志细胞增殖活性的PCNA指数呈正相关。Hasegawa等[13]和Park[14]在研究中发现骨肉瘤及软骨肉瘤等肿瘤中PCNA均为高阳性表达(58.6%～73.3%),同时细胞核中阳性表达呈弥漫性者较呈局限性者预后差,生存期明显缩短。Nakashima等[15]检测26例骨肉瘤标本，结果显示PCNA的阳性率为80.8%。细胞过度增殖可促进肿瘤的发生、浸润和转移。本研究显示PCNA在骨肉瘤的阳性表达率为84.6%,明显高于骨软骨瘤(13.3%)，表明骨组织一旦恶变便有很高的增殖率，PCNA与骨肉瘤细胞的增殖状态密切相关。其高表达是骨肉瘤增殖活跃的重要指标，显示其参与骨肉瘤细胞的增殖过程并与骨肉瘤的进展和预后有关。提示作为评价细胞增殖状态的PCNA，结合其它指标可作为诊断骨肉瘤及判断其预后的客观指标。 本研究结果显示，P14ARF和PCNA其表达与年龄、性别、组织类型均无相关性(P>0.05)，提示二者对于鉴别骨肉瘤组织类型没有意义;未显示其表达与民族具有相关性(P>0.05)，可能由于样本量小或其在骨肉肿瘤发生、发展过程中与其他基因具有共同调控环节的缘故，与不同民族的遗传背景关系不大。综上所述,P14ARF与PCNA表达可作为诊断骨肉瘤及评价其预后的辅助指标。

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