非小细胞肺癌组织EGFR与NFκB p65表达及其意义

　　作者：周璇，项锋钢，谷海燕，冉雯雯 作者单位：(青岛大学医学院附属医院病理科,山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)与核因子κB(NFκB) p65在非小细胞肺癌 (NSCLC) 组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用SP9000通用型三步法检测63例NSCLC组织中EGFR、NFκB p65的表达，以20例正常肺组织作为对照。结果 EGFR、NFκB p65在NSCLC组织中阳性表达率明显高于正常肺组织(χ2=17.24、28.61,P<0.01)。EGFR、NFκB p65的表达与NSCLC分化程度、TNM分期及是否伴有淋巴结转移有关(Z=-2.920～-2.292,P<0.05);而与病人性别、年龄及病理类型无关(P>0.05)。结论 EGFR、NFκB的过度表达与NSCLC的发生、细胞增殖及浸润转移相关，可作为预后观测的指标和分子治疗的新靶点。

　　【关键词】 癌,非小细胞肺;受体,表皮生长因子;NFκB;免疫组织化学

　　EXPRESSIONS OF EGFR AND NFκB p65 PROTEINS AND THEIR SIGNIFICANCE IN NONSMALL CELL LUNG CANCERZHOU XUAN, XIANG FENGGANG, GU HAIYAN, et al (Department of Pathology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To study the expressions of EGFR and NFκB p65 in NSCLC and their correlation with the clinicopathologic features. Methods Threestep immunohistochemistry was used to detect the expressions of EGFR and NFκB p65 in 63 cases of NSCLC and 20 of normal lung tissue. Results The expressions of EGFR and NFκB p65 in the cancer were significantly higher than that in nomal lung tissue (χ2=17.24,28.61;P<0.05). The expressions were associated with tumor differentiation,TNM staging, and whether or not with lymph node metastasis (Z=-2.920--2.292,P<0.05), but not related to gender, age and type of pathology (P>0.05). Conclusion The overexpressions of EGFR and NFκB are related to the occurrence, cell proliferation, infiltration and metastasis of NSCLC, which can be used as an index to predict the prognosis and a new target of molecular therapy for this disease.

　　[KEY WORDS] carcinoma, nonsmall cell lung; receptor, epidermal growth factor; NFkappa B; immunohistochemistry

　　表皮生长因子受体(EGFR)是cerbB2基因家族的表达产物，生理状态下对细胞的生长和分化起调节作用，其过度表达与细胞的增殖和癌变有关。近年来的研究发现，人类肺癌组织有EGFR的过度表达[1]。核因子(NF)是一种具有多向性转录调节作用的多肽，通过启动和调节多种肿瘤相关基因的转录，从而促进细胞增殖，抑制凋亡，使细胞发生恶性转化，并促使肿瘤细胞的转移[2]。 本研究应用SP9000通用型三步法分别检测了63例非小细胞肺癌(NSCLC)组织及20例正常肺组织中EGFR和核因子κB(NFκB) p65的表达情况，旨在探讨两者表达与NSCLC临床病理特征及NSCLC发生、发展以及侵袭、转移的关系。 现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本

　　随机收集2006年1月—2009年1月我院病理科经病理证实的NSCLC组织标本63例，其中男49例，女14例;年龄44～75岁，平均60.2岁，中位年龄60岁。病人术前均未接受过放化疗。63例中鳞癌37例(高分化6例，中分化7例，低分化24例)，腺癌26例(高分化4，中分化9例，低分化13例);TNM临床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期6例;有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者27例。取20例癌旁5 cm以上远端正常肺组织作为对照组。

　　1.2 试剂

　　兔抗人EGFR单克隆抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，鼠抗人NFκB p65 SC8008单克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，过氧化物酶标记的链霉卵白素(StreptavidinPeroxidase)染色试剂盒(通用型)及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 免疫组织化学染色

　　所有组织标本4 μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，系列乙醇水化至蒸馏水，采用体积分数0.03的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，微波抗原修复(枸橼酸缓冲液 pH 6.0)、体积分数0.10的山羊血清封闭抗原，分别行抗EGFR、抗NFκB p65免疫组织化学染色(SP9000通用型三步法)、DAB显色剂显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

　　1.4 免疫组织化学染色结果判定

　　EGFR以肿瘤细胞的胞浆和(或)胞膜出现棕黄色颗粒着色为阳性，NFκB p65以肿瘤细胞的胞浆和(或)胞核出现棕黄色颗粒着色为阳性。参照IRS法[3]计数，并观察阳性细胞染色强度。按阳性细胞百分数记为0～3分：<5%为0分，5%～30%为1分，31～60%为2分，>60%为3分。按细胞的染色强度记为0～3分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞百分数记分和染色强度记分相乘所得总分进行判断，总分0分为阴性(-)，1分为弱阳性(+)，2～4分为阳性()，>4分为强阳性()。

　　1.5 统计学分析方法

　　采用SPSS 11.5及PPMS 1.5[4]统计软件对所得数据进行统计学分析。NSCLC组织与正常肺组织中EGFR、NFκB p65的表达差异及NSCLC组织中EGFR、NFκB p65的表达与临床病理特征的关系比较，分别采用χ2检验及MannWhitney U检验。 EGFR与NFκB p65在NSCLC组织中表达的相关性采用Pearson相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 EGFR和NFκB p65在NSCLC组织中的表达及与临床病理特征的关系

　　在NSCLC组织中，EGFR和NFκB p65的表达在NSCLC病人的不同性别、年龄、病理类型方面，差异无显著相关性(P>0.05);但二者表达在不同NSCLC的分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移方面，差异有显著性(Z=-2.920～-2.292，P<0.05)。见表1。

　　2.2 EGFR和NFκB p65在NSCLC组织及正常肺组织中的表达比较

　　63例NSCLC组织中EGFR和NFκB p65的阳性率分别为76.2%和79.4%，而20例正常肺组织中EGFR和NFκB p65的阳性率分别为25.0%和15.0%，NSCLC组织中EGFR和NFκB p65阳性表达率显著高于正常肺组织，差异有显著性(χ2=17.24、28.61,P<0.05)。见表2。

　　2.3 EGFR和NFκB p65在NSCLC组织中表达的相关性

　　相关分析表明，EGFR的表达与NFκB p65呈正相关(r=0.414，P<0.05)。见表3。表1 EGFR和NFκB p65在NSCLC组织表达与临床病理特征的关系临床病理特征表2 EGFR和NFκB p65在NSCLC组织及正常肺组织中的表达比较组表3 EGFR与NFκB p65蛋白在NSCLC组织中表达的关系

　　3 讨 论

　　3.1 EGFR在NSCLC组织表达与临床病理特征的关系EGFR是cerbB2基因家族cerbB1的表达产物，基因定位于第7号染色体短臂。与表皮生长因子或转化生长因子内α结合后能促进受体的酪氨酸激活，使其残基自身磷酸化，提供持续分裂信号到细胞内膜，引起细胞增殖、分化，逐步演变成肿瘤。人类的许多肿瘤都检测到EGFR表达，并通过自分泌、旁分泌作用促进肿瘤生长[5]。

　　本实验结果显示，NSCLC组织中EGFR表达明显高于正常肺组织，说明EGFR在肺癌发生、发展中起作用。实验显示正常肺组织也有少量EGFR阳性表达，而部分NSCLC组织则没有EGFR的表达，这是由于肿瘤发生、发展为多因素作用的结果。分子生物学已证明，肿瘤发生发展中存在癌基因激活和抑癌基因的失活，推测正常肺组织中既有促分裂因素，也有抗分裂因素，多种因素处于动态平衡中。如果该平衡被破坏，肿瘤则可能发生。肺癌不仅只由EGFR过度表达产生，而其他因素也可能在未表达EGFR的肺癌中起明显作用。本文的研究结果显示，EGFR在NSCLC组织中的表达与病人的性别、年龄及病理类型无关，这是由于EGFR与其配体结合后促使细胞分裂增殖所必需的酶、蛋白质的合成增多，从而导致肿瘤的发生。但同时，EGFR的表达在NSCLC不同的肿瘤分化程度、TNM分期及是否有区域淋巴结转移方面差异显著。低分级、高分期的肿瘤，EGFR表达较强，表明在肿瘤生长过程中，因其处于生长活跃期，EGFR基因转录增加，使得低分级、分期高的肿瘤中出现高表达。这与PAVELIC等[6]报道的结果基本相同。此外，本研究结果显示，有区域淋巴结转移的病人NSCLC组织中EGFR表达高于没有区域淋巴结转移的病人，两者之间差异有显著意义(P<0.01)，与OHSAKI 等[1]的结论相似。提示肺癌细胞中存在一个自泌环能分泌生长因子并表达相应的受体，影响细胞的移动性，不断促进肺癌细胞生长，因而其在肺癌的转移中扮演重要的角色。PIANETTI等[7]在体内、体外实验中发现，EGFR可通过PI3/Akt激酶通路激活NFκB P65蛋白，表明NFκB P65蛋白和EGFR确实存在着密切联系，两者共同参与NSCLC的转移过程，但确切机制有待进一步研究。

　　3.2 NFκB在NSCLC组织表达及与临床病理特征的关系

　　NFκB是一种具有多向性转录调节作用的多肽，在静息细胞中NFκB以蛋白二聚体与特异性抑制蛋白——超级抑制物IκB形成三聚体，以非活化形式存在于细胞浆。最常见的二聚体是p50与p65组成的异源二聚体，p50的主要功能是与DNA结合，一般不具有转录激活功能，发挥转录激活作用的是p65。在细胞受到外界刺激时，NFκB三聚体中的IκB因发生磷酸化而失活，使NFκB活化进入细胞核内，在细胞核内与相应基因上的NFκB结合位点发生特异性结合，激活特异性靶基因的转录，通过启动和调节相关基因的转录，从而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[9]。

　　近年来有研究表明，NFκB在NSCLC组织中存在过多表达[9]。本研究结果显示，NFκB p65在NSCLC组织表达明显高于正常肺组织，差异有显著性，说明NFκB 过度活化在NSCLC发生、发展过程中起重要作用。在正常肺组织中，NFκB p65免疫组化染色阳性表达强度和阳性细胞数也明显弱于肿瘤组织，说明在非肿瘤组织中NFκB处于不断的激活和失活的有序调控中，而在肿瘤组织中NFκB失去控制而被过度激活，从而导致某些受NFκB调控、与促进细胞增殖或抑制细胞凋亡有关的下游靶基因也被过度激活，导致细胞过度增殖，肿瘤发生发展。本研究结果表明，NFκB p65的表达与病人性别、年龄、病理类型无关，而与肿瘤分化程度、TNM分期和有无淋巴结转移有关。在低分化NSCLC组织中NFκB p65表达强度明显高于中、高分化肺癌组织，提示NFκB 的高表达与NSCLC的恶性程度密切相关，分化越差，细胞恶性程度越高，NFκB越倾向于高表达，肿瘤细胞越容易增殖。有区域淋巴结转移组NFκB p65表达明显高于无淋巴结转移组，也提示了NFκB过度活化与NSCLC的侵袭、转移有关，NFκB高表达促进了NSCLC淋巴结转移。有研究表明，肿瘤细胞和基质中的纤溶酶原激活物尿激酶(uPA)和基质金属蛋白酶(MMPs)的表达受到NFκB的调控，活化的NFκB 可以促进肿瘤转移相关因子如MMP、uPA等的表达，从而促进细胞外基质的降解和肿瘤细胞的迁移和增殖，从而使肿瘤发生转移。随着TNM分期的增高，NFκB的表达程度增高，更加说明了NFκB的过度表达在NSCLC的发生、发展中起重要作用。NFκB高表达与NSCLC的发生、细胞增殖及浸润转移相关，这与桑崇铃等[9]的研究结果相一致。

　　总之，EGFR和NFκB与NSCLC的发生、发展及浸润转移密切相关，以EGFR和NFκB作为肿瘤治疗新靶点，利用EGFR和NFκB抑制剂来治疗肿瘤也取得了进展，所以对两者的进一步深入研究将会对肺癌的诊治带来新思路和希望。

　　【参考文献】

　　[1]OHSAKI Y, TANNO S, FUJITA Y, et al. Epidermal growth factor receptor expression correlates with poor prognosis in nonsmall cell lung cancer patients with p53 overexpression[J]. Oncol Rep, 2000,7(3)：603.

　　[2]GILMORE T D. The Rel/NFкB signal transduction pathway：introduction[J]. Oncogene, 1999,18:68426844.

　　[3]孔庆兖,卢敏华,陈菊荣,等. 109例胃肠道间质瘤临床病理研究[J]. 徐州医学院学报, 2000,20(5)：354357.

　　[4]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

　　[5]SPORN M B, ROBERTS B. Autocrine seretion：10 years later[J]. Ann Intern Med, 1992,117(5)：408.

　　[6]PAVELIC K, BANJACZ, PAVELIC J, et al. Evidence for a role of EGF receptor in the progression of human lung carcinoma[J]. Anticancer Res, 1993.13(4)：1133.

　　[7]PIANETTI S, ARSURA M, ROMIEUMOUREZ R, et al. Her2/neu overexpression induces NFkappa B via a PI3kinase/Akt pathway involving calpainmediated degradation of IkappBalpha that can be inhibited by the tumor suppression PTEN[J]. Oncogene, 2001,20(11)：12871299.

　　[8]TING A Y, ENDY D. Singal transduction：decoding NFκB signaling[J]. Science, 2002,298：11891190.

　　[9]桑崇铃,李强. NFκB在NSCLC组织中的表达及其意义[J]. 临床肺科杂志, 2007,12(12)：13151316.