食管癌患者外周血中CK19mRNA、CYFRA21-1、TPS联合检测的临床意义

　　作者：俞军 周晓明 何晓松 戴美红 作者单位：210009江苏省南京市，江苏省肿瘤医院科研科

　　【摘要】 目的 评价食管癌患者外周血中微转移基因标记物细胞角蛋白19(CK19)mRNA和细胞角蛋白片段211(CYFRA211)、组织多肽特异性抗原(TPS)联合测定的临床价值。 方法 取48例食管癌患者术前外周血标本，应用巢式逆转录聚合酶链反应法(nestedPCR)检测外周血单个核细胞CK19 mRNA的表达，同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定患者血清CYFRA211和TPS水平。 结果 食管癌患者外周血中CK19 mRNA和血清CYFRA211和TPS的阳性检出率分别为 52.1% 、83.3%和66.7%。联合检测CK19 mRNA 、CYFRA211和 TPS在食管癌患者中的阳性表达，发现其与患者肿瘤细胞分化程度、浸润深度、临床分期及有无淋巴结转移和远处转移等有相关性(P<0.05或P<0.01)。 结论 在食管癌患者的随访中开展外周血中CK19 mRNA和血清CYFRA211和TPS的联合检测可提高食管癌微转移的检出率，以及时监控患者的病情。

　　【关键词】 食管癌; 细胞角蛋白19; 细胞角蛋白片段211; 组织多肽特异性抗原; 巢式逆转录聚合酶链反应; 酶联免疫吸附法

　　Clinical value of combined detection of CK19 mRNA,CYFRA211 and TPS in peripheral blood cells of patients with esophageal carcinoma YU Jun, ZHOU Xiaoming, HE Xiaosong, DAI Meihong. Jiangsu Province Tumor Hospital, Nanjing 210009, China 　【Abstract】　Objective To investigate the expression of cytokeratin 19 (CK19) mRNA, CYFRA211 and TPS in peripheral blood cells of patients with esophageal carcinoma and evaluate its clinical significance. Methods Peripheral blood nucleated cells of 48 patients with esophageal carcinoma were studied by nestRTPCR to detect the expression of CK19mRNA, meanwhile, ELISA assay was used to detect the expression of CYFRA211 and tissue polypepitde specific antigen (TPS) in serum. Results The positive rate of CK19 mRNA, CYFRA211 and TPS in patients with esophageal carcinoma was 52.1%,83.3% and 66.7% respectively. There was significant difference in the expression of CK19 mRNA, CYFRA211 and TPS between patients with different differentiation grade， invasive depth, clinical staging ，lymphatic metastasis and distant metastasis. Conclusions Combined detection of the expression of CK19 mRNA. CYFRA211 and TPS in peripheral blood nucleated cells increases the sensitivity of detecting hematogenous dissemination of cancer cells. Long term survival analysis and more specimens would be helpful for evaluating its clinical significance.

　　【Key　words】 esophageal carcinoma; cytokeratin19; cytokeratin211; tissue polypeptide specific antigen; nest reverse transcriptase polymerase chain reaction; enzymelinked immunosorbent assay

　　准确评价肿瘤患者的血液和淋巴结转移状况具有重要的临床意义, 近年研究表明恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就可能有癌细胞入血, 即微转移。 而传统的检查方法常低估微转移的存在。随着分子生物学的发展,巢式逆转录聚合酶链反应法(nestedPCR)可在1×107个单个核细胞中检出1～10个肿瘤细胞,其检测肿瘤微转移的敏感性、特异性较其他方法均大大提高[1]。细胞角蛋白19(CK19)mRNA几乎可在所有的上皮细胞、上皮类肿瘤细胞及部分非上皮类肿瘤细胞中表达，而在外周血细胞中无表达[2]。本研究通过应用nestedPCR检测CK19 mRNA 在食管癌患者外周血中的表达,同时联合检测血清细胞角质蛋白片段211(CYFRA211)、组织多肽特异性抗原(TPS)水平，初步探讨其在判断食管癌微转移中的临床价值。

　　1 材料和方法

　　1.1 一般资料 随机选择我院2006年10月至2009年6月胸外科收治入院的48例食管癌患者，术前未经放、化疗，取外周血及血清。年龄55～72岁，平均(62.8±2.3)岁,男32例,女16例。所有患者取外周血3 ml EDTANa2抗凝，用淋巴细胞分离液离心2000 r/min，30 min。收集界面细胞，用生理盐水洗涤1次后置-20 ℃保存待用。

　　1.2 试剂和仪器 淋巴细胞分离液购自上海生物工程技术公司;TriPure试剂盒、DEPC、 TaqDNA聚合酶、dNTP、 DNaseI、RNasin均购自Roche公司;TAKARA一步法nestedPCR试剂盒购自大连宝生生物技术公司;所有引物由上海生工生物公司合成，CK19上游引物:5′AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA3′，下游引物:5′ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA3′，内参照βactin上游引物:5′ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3′，下游引物:5′CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3′;CYFRA211试剂盒购自芬兰Wallac AB公司;TPS试剂盒为瑞典IDL Biotech AB公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 外周血中总RNA提取：每份样品以EDTANa2抗凝,淋巴细胞分层液(密度1.0772 kg/L)梯度离心提取单个核细胞;肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液;TriPure一步法分别提取总RNA,以无RNA 酶之DNA 酶Ⅰ去除混杂的DNA;核酸分析仪进行RNA定量。

　　1.3.2 CK19 mRNA表达水平检测：取mRNA 1 μg 逆转录为cDNA，以βactin为内参照与CK19分别进行nestedPCR扩增，扩增条件:第1 轮扩增(outer)： 95 ℃ 5 min, 95 ℃ 0.5 min, 72 ℃ 1 min,20个循环后,72 ℃10 min。取第1 轮扩增产物行第2 轮扩增(inner)：95 ℃ 5 min,95 ℃ 0.5 min,72 ℃ 1 min,30个循环后,72 ℃10 min。4 ℃保存。取10μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统分析，CK19长度为745bp，βactin长度为116bp，两者同时出现为阳性。另取10例正常健康医务人员外周血为CK19 mRNA nestedPCR检测的阴性对照;15例经我院病理科确诊为食管癌的肿瘤组织作为CK19mRNA巢式RTPCR检测的阳性对照。

　　1.3.3 血清CYFRA211和TPS水平的测定：取外周血2 ml分离血清，保存于-20 ℃备用。CYFRA211阳性判定标标准为>3 μg/L。TPS阳性判定标准为>1 μg/L。所有操作严格按试剂盒说明书进行操作。

　　1.4 统计学分析 本组资料数据统计使用SPSS 6.0，计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 外周血CK19 mRNA表达情况 食管癌细胞ECA109经3倍比稀释法制成的1∶10 ～1∶106梯度模型经过nestedPCR 后在4 次1∶106 模型中均可见到CK19 mRNA特异性条带745 bp,灵敏度至少为1∶106,相当于1 ml全血中含有1个肿瘤细胞。48例食管癌患者外周血CK19 mRNA检测阳性25例(52.1%)。见图1。

　　1：阳性对照;2～3：食管癌患者外周血标本;4：阴性对照

　　图1 nestedPCR检测外周血CK19 mRNA表达情况(略)

　　2.2 血清CYFRA211和TPS水平表达情况 48例食管癌患者中，血清CYFRA211和TPS水平检测阳性率分别为83.3%(40/48)和66.7%(32/48)。

　　2.3 联合检测外周血CK19mRNA、血清CYFRA211和TPS阳性表达情况与食管癌患者临床病理关系 48例食管癌患者外周血中,CK19 mRNA单基因阳性表达在不同年龄、性别、浸润深度和细胞分化程度的患者中无统计学差异，但是与肿瘤临床分期、是否发生淋巴和远处转移有关(P<0.05)。CK19mRNA +CYFRA211或CK19mRNA +TPS联合检测阳性表达与肿瘤细胞分化程度、浸润深度、临床分期及有无淋巴结转移和远处转移等均有相关性(P<0.05或P<0.01)。见表1。

　　3 讨论

　　肿瘤的微转移一般是指非血液系统恶性肿瘤在发展过程中,散播并存活于淋巴系统、血液系统、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小癌细胞灶,它可以是单个癌细胞或独立的癌细胞灶,无特殊血供,常无任何临床表现[34]。研究认为,肿瘤临床转移一般皆由微转移发展而来，微转移的癌细胞灶常以单个细胞或微小细胞团形式,通过淋巴结系统、血液系统转移至其他组织器官,也可直接侵袭周围组织或种植于体腔。当机体遭受打击或免疫力下降时,休眠的肿瘤细胞摆脱抑制状态而持续增殖,最终发展为临床转移。

　　表1 CK19 mRNA、CYFRA211和TPS检测阳性率比较(略)

　　注：同项目中不同子项间比较，*P<0.05,**P<0.01

　　常规检查方法如CT、MRI 及普通病理学检查等均很难发现肿瘤的微转移。如何检测以及对肿瘤转移的早期诊断一直是研究的热点。nestedPCR 可在1×107个单个核细胞中检出1～10个肿瘤细胞,其敏感性和特异性适宜于微转移的检测 。本研究应用nestedPCR方法检测CK19mRNA在食管癌患者外周血中的表达,灵敏度至少为1∶106(即可在1ml全血中检测到1个肿瘤细胞);同时还联合ELISA法检测血清中CYFRA211和TPS的表达，初步探究相关基因表达的检测在判断食管癌微转移方面的临床价值。

　　细胞角蛋白(CKs) 是分布于上皮细胞的中间纤维,其表达方式反映了上皮细胞分化的不同途径[2，5]，其检测主要应用于胃肠道、乳腺、前列腺及肺的恶性肿瘤[67]。近年来，CKs作为检测循环癌细胞的指标，越来越得到人们的重视。本文资料显示，在0～Ⅱ期食管癌患者中CK19 mRNA阳性率为16.7%(表1)，在排除上皮细胞污染等因素的前提下，提示患者可能实际已有血源性微转移。CK19 mRNA作为微转移检测的基因标记有较高的应用价值，但也有一定的局限性。本文结果显示，单独检测CK19 mRNA阳性率仅与肿瘤临床分期、是否发生淋巴和远处转移有关(P<0.05)。但是CK19 mRNA +CYFRA211或CK19 mRNA +TPS联合检测则与肿瘤细胞分化程度、浸润深度、临床分期及有无淋巴结转移和远处转移等方面均有相关性(P<0.05或P<0.01)。可见，CK19 mRNA与肿瘤标记物CYFRA211或TPS联合检测可提高检测的敏感性[89]，这有助于对食管癌患者的病情和肿瘤是否有远处转移进行判断。CK19 mRNA检测也存在假阴性的可能，与肿瘤细胞异质性有关;由于肿瘤细胞进入体液可能是间断的，故应多次抽取标本检测，才能取得理想的结果。

　　综上所述，CK19 mRNA的阳性检出率对于判断食管癌微转移具有一定临床意义，开展其与CYFRA211或TPS的联合检测，则灵敏性和特异性更高。对食管癌患者术后标本中外周血CK19 mRNA检测阳性的病人应密切跟踪、随访,以期尽早发现病人的体内转移。这样可以减少食管癌患者术后远处转移及复发，对争取获得良好的预后、提高食管癌以手术为主的综合治疗的疗效具有重要临床意义。

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