EphA2、EphrinA1在原发性肝细胞癌组织中的表达及与血管生成的关系

　　作者：周为 张宇 作者单位：1.青海大学附属医院肿瘤外科;2.青海红十字医院肿瘤科

　　【摘要】 目的 了解EphA2与其配体EphrinA1在原发性肝细胞癌组织中的表达及与肿瘤血管生成的关系 。方法 利用免疫组化方法检测43例原发性肝细胞癌手术切除标本中癌组织 、癌旁组织及正常肝组织EphA2、EphrinA1的表达 ,并采用CD34抗体标记计算微血管密度 (MVD )。分析EphA2、EphrinA1的表达与 MVD之间的相关性。结果 原发性肝癌组织中EphA2、EphrinA1的表达及 MVD 显著高于癌旁组织及正常肝组织( P < 0. 05) ; MVD 值与肿瘤直径有关(P < 0. 05)，等级相关分析表明 , EphA2、EphrinA1 表达分别与 MVD 呈显著正相关(r=0.683, P<0.01;r=0.492，P<0.01)。 结论 EphA2及其配体EphrinA1在原发性肝细胞癌组织中呈特异性高表达 ,提示其可能参与肿瘤血管的生成 。 周为(1965～)，男，汉族，青海籍，副主任医师

　　【关键词】 原发性肝细胞癌 EphA2 EphrinA1 血管生成

　　THE EXPRESSION OF EphA2、EphrinA1 AND THE

　　RELATIONS OF ANGIOGENESIS IN PHC TISSUES

　　Zhou Wei1, Zhang Yu2

　　(1. The surgical oncology department,the affiliated hospital of Qinghai university;

　　2.The oncology department,the red cross hospital of Qinghai)

　　Abstract Objective To detect the expression of EphA2 and its ligand--EphrinA1 with immunohistochemistry and determine the relations of angiogenesis .Methods We’ve detected the expressions of EphA2 and EphrinA1 in carcinoma , paracarcinoma and normal tissues in 43 cases with PHC(primary hepatic carcinoma)and calculated MVD(micro-vessel density) marked with CD34 antibody .The correlations between the expression of EphA2 and EphrinA1 and MVD is analyzed . Results the expressions of EphA2 , EphrinA1 in PHC tissues and MVD is significantly higher than that in paracarcinoma and normal tissues(P<0.05);MVD values are correlated with the diameters of tumors(P<0.05)and the expressions of EphA2 , EphrinA1 are positively correlated significantly with MVD ,respectively(r=0.683, P<0.01;r=0.492，P<0.01).Conclusion EphA2 and its ligand--EphrinA1 are specificly expressed with a high level in PHC and may take an important role in angiogenesis and maliogenesis of PHC.

　　key words Primary hepatic carcinoma (PHC) EphA2 EphrinA1 Angiogenesis

　　受体酪氨酸激酶( receptor tyrosine kinases, RTKs)是外界刺激信息传递至细胞核,转化成细胞效应的信号，是转导通路中的关键分子组成。Eph基因家族是新发现的最大的RTKs家族成员, EphA2是该家族中被发现具有酪氨酸激酶活性的第一个基因[1]。研究表明, EphA2可在多种人体肿瘤组织中过表达,促进肿瘤向恶性表型发展[2]。有研究显示, EphA2能促进血管内皮细胞的迁移,与其配体EphrinA1结合可促进组织和内皮细胞形成毛细血管样结构,在肿瘤新生血管形成及侵袭转移中发挥重要作用[3-5]。目前,有关原发性肝细胞癌组织中EphA2及其配体的表达以及二者与血管生成关系的研究鲜见。本实验采用免疫组织化学法检测原发性肝细胞癌组织、癌旁组织及正常肝组织中EphA2、EphrinA1的表达,用CD34标记血管内皮细胞,测定微血管密度(microvessel density,MVD),通过分析EphA2、EphrinA1表达及其与MVD之间的相关性,探讨EphA2及其配体EphrinA1对原发性肝细胞癌中血管生成的作用及临床意义 。

　　1 材料与方法

　　1. 1 标本

　　收集青海大学附属医院2005年2月～2008年2月原发性肝细胞癌手术切除标本43例,其中男性31例,女性12例,年龄32～65岁,中位年龄54岁,术前均未经过放、化疗。其组织学类型均为原发性肝细胞癌,每例标本分别取癌组织 、癌旁组织(距癌边缘1. 5～2 cm )及正常肝组织(均在镜下证实无瘤细胞)。标本固定于10%中性福尔马林溶液，常规制片。

　　1. 2 主要试剂

　　EphA2 ( clone C220) 、EphrinA1 ( clone v218)兔抗人多克隆抗体购于Santa Cruz公司, CD34 ( ZM 20046)鼠抗人单克隆抗体购于北京中杉生物技术有限公司, 免疫组化二抗试剂盒( SP9000)购于北京中杉生物技术有限公司。

　　1. 3 免疫组织化学法

　　采用链霉素-生物素过氧化物酶(S2P)染色法,具体操作步骤按S2P试剂盒说明进行。EphA2一抗、EphrinA1一抗和CD34一抗稀释浓度均为1∶100。设立阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照 。

　　1. 4 EphA2、EphrinA1表达结果判断法

　　EphA2和EphrinA1为细胞质/膜着色,根据显色强度分为0～3级。0级 :阴性 ( - ) ,细胞无棕黄色染色; 1级:弱阳性( + ) ,细胞染色较淡; 2级 :阳性 ( + + ) ,细胞中度染色; 3级:强阳性 ( + + + ) ,细胞染色较深 。

　　1. 5 CD34表达结果判定及 MVD计数方法

　　CD34表达结果判断方法:每一个染成棕黄色的，可与周围血管、肿瘤细胞和其他结缔组织区分开来的内皮细胞或内皮细胞簇,不论管腔和红细胞出现与否,均作为一个单一的、可计数的微血管; 管腔面积> 8个红细胞直径, 或带有较厚肌层的微血管不计数。

　　MVD计数方法:先于低倍光镜 (×40和×100)下确定3个血管着色最密集区域,然后在高倍视野(×400)内计数微血管的数目, 取3个视野的均值作为MVD。结果判定应用双盲法(每张切片由两位病理医师分别判定、计数)。两人计数结果相差10%以上的重新计数。

　　1. 6 统计学处理方法

　　采用SPSS 13.0统计软件, 计量资料以x±S表示 ,采用两独立样本t检验;计数资料比较采用χ2检验;EphA2、EphrinA1蛋白表达相关性采用Spearman等级相关分析 。

　　2 结果

　　2. 1 原发性肝细胞癌组织、癌旁组织及正常肝组织中EphA2、EphrinA1的表达(见表1)

　　表1显示，在原发性肝细胞癌组织中, EphA2、EphrinA1蛋白的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织(P < 0. 0125 ) ,而癌旁组织与正常肝组织之间无显著性差异(P > 0. 0125)。

　　在原发性肝细胞癌组织中,有转移者及包膜不完整者的EphA2、EphrinA1蛋白表达均与无转移者及包膜完整者有显著性差异( P<0. 05 ) 。

　　2.2 CD34的表达及MVD测定(见表2)

　　CD34主要表达于血管内皮细胞膜。微血管染色呈棕黄色,最密集染色区域主要位于癌巢及癌细胞密集区。癌组织中MVD(26.32 ±11.01)与癌旁组织( 14.58 ±8.53 ) ( P<0. 01)及正常肝组织(14.69 ±7.24) (P < 0.05)比较均有显著性差异,而癌旁组织与正常肝组织MVD比较无显著性差异(P>0. 05)。

　　2. 3 EphA2、Eph rinA1表达与MVD的相关性(见表3)表1EphA2、EphrinA1在各组织中的表达

　　2.2 EphA2、EphrinA1的表达及其与原发性肝细胞癌临床病理特征的关系(见表2)表2PHCC中EphA2、EphrinA1表达、MVD与病理学参数关系表3EphA2、EphrinA1表达与MVD的相关性经Spearman等级相关分析, EphA2表达与MVD呈显著正相关(r=0. 683,P<0.01), EphrinA1表达与MVD呈显著正相关( r = 0. 492,P < 0. 01) 。

　　3 讨论

　　EphA2可以通过细胞外配体结合区与其配体EphrinAl结合,形成受体 -配体复合物,激活细胞质的酪氨酸磷酸酶而活化,导致自身磷酸化及下游大量细胞内底物蛋白分子的酪氨酸磷酸化,启动不同的信号传导通路,从而引起一系列生物效应:参与细胞的生长、迁徙和分化活动,在胚胎发育、血管的发生、肿瘤的形成等方面发挥重要作用。研究表明,EphA2与其配体EphrinAl可高表达于许多恶性肿瘤组织中,包括乳腺癌、结肠癌、食管癌及前列腺癌[6，7]等,但在原发性肝细胞癌中，EphA2与其配体的表达情况及其与临床病理特征的关系还不十分清楚。本实验结果显示，原发性肝细胞癌组织中EphA2、EphrinA1的表达明显高于癌旁组织及正常肝组织,且其表达水平与有无完整包膜、有无转移情况呈正相关。以上结果表明EphA2及配体EphrinA1在原发性肝细胞癌组织中呈特异性高表达,其表达水平的升高与肿瘤恶性程度的增加及转移的发生密切相关。研究显示 ,肿瘤恶性程度的增加可导致细胞间黏附性的下降,使EphA2与其配体的结合及后续降解受阻,从而大量堆积于肿瘤细胞表面,无法发挥正常生理作用,反而促进恶性细胞的生长、迁徙和浸润[2，8,9]。因此,我们认为联合检测EphA2、EphrinA1对预测肝癌预后具有重要的临床意义 。

　　血管生成(angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而成新生血管的过程。肿瘤组织的增殖依赖血液供应,血管生成在肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥重要作用。研究表明, EphA2及其配体EphrinA1在许多恶性肿瘤的血管内皮细胞中共表达,二者的结合可促进肿瘤血管内皮细胞的迁移,并通过影响细胞骨架、基质黏附和(或)细胞黏附而促进组织和内皮细胞形成毛细血管样结构,而抑制EphA2的活化可以削弱肿瘤的血管形成,提示EphA2在肿瘤新生血管形成及侵袭转移中发挥重要作用[10,11]。MVD是用CD34标记肿瘤血管,对肿瘤的血管生成进行直接观察并量化的方法,是反映肿瘤侵袭转移等生物学行为的一个重要指标[12,13]。本实验结果显示,原发性肝细胞癌组织中MVD显著高于癌旁组织及正常肝组织,MVD在原发性肝细胞癌包膜不完整、淋巴结转移阳性及肿瘤直径≥5cm者中显著升高,且与EphA2及其配体EphrinA1的表达呈显著正相关,表明EphA2可能发挥了血管促进剂的作用,在原发性肝细胞癌血管形成过程中扮演了重要角色。EphA2可能通过促进肿瘤新生血管形成机制参与原发性肝细胞癌的发生和发展过程,不仅促进了原发性肝细胞癌原发瘤的生长,还为其血道转移提供了更多机会,与肿瘤的预后密切相关[14]。因此,在原发性肝细胞癌的临床治疗中,抑制EphA2的活化可削弱肿瘤的血管形成,从而抑制肿瘤的生长和转移。深入开发和应用选择性EphA2抑制剂有望为原发性肝细胞癌的预防和治疗开辟新的途径 。

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