WWOX蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

　　作者：李秋芳，杨瑞玲，王静，吴逸明 作者单位：1. 郑州大学护理学院临床教研室，河南郑州 450052;2. 河南大学第一附属医院药剂科，河南开封 475001;3. 郑州大学第一附属医院呼吸内科，河南郑州 450052;4. 郑州大学公共卫生学院，河南郑州 450052

　　【摘要】目的 探讨WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)基因在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法 用免疫组化方法检测50例鳞癌、31例腺癌及20例癌旁正常组织中WWOX基因蛋白的表达，并分析其与各临床病理指标之间的相关性。结果 WWOX基因在72.8%的非小细胞肺癌中失表达或表达减少，而在相邻正常肺组织中有80.0%正常表达。WWOX基因的表达与组织类型、细胞分化程度密切相关(P<0.05)，在鳞癌和低分化癌中WWOX基因失表达或表达减少。结论 WWOX蛋白在非小细胞肺癌组织中呈低表达，该蛋白表达的缺失可能在不同类型非小细胞肺癌的形成中发挥了不同的作用。

　　【关键词】 非小细胞肺癌 WWOX基因 WWOX蛋白

　　WWOX gene expression in non-small cell lung cancerand its clinical significance

　　Li Qiufang, Yang Ruiling, Wang Jing, Wu Yiming

　　(1. Clinical Department, Nursing College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052;2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001;

　　3. Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,

　　Zhengzhou 450052; 4. College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the expression of WWOX gene in non-small cell lung cancer and its significance. Methods WWOX protein expression was evaluated by immunohistochemistry in 81 NSCLC patients (50 squamous cell carcinomas, 31 adenocarcinomas and 20 adjacent normal lung tissues), and correlation with histopathologic (histotype, grade, tumor-node-metastasis, stage) and clinical characteristics was studied. Results WWOX expression was absent/reduced in 72.8% of NSCLC, whereas it was normal in 80.0% of adjacent normal lung tissues. WWOX expression was strongly associated with tumor histology and histologic grade (P<0.05), the percentage of cases with absent/strongly reduced WWOX expression was higher in squamous cell carcinomas and in poorly differentiated tumors. Conclusion The loss of WWOX expression plays a different role in tumorigenesis of distinct histotypes of NSCLC.

　　KEY WORDS: non-small cell lung cancer (NSCLC); WWOX gene; WWOX protein

　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率呈明显上升趋势，已位居肿瘤第一位[1]。非小细胞肺癌有不同的组织类型、临床行为和短的生存期。WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)基因是近年来发现的一个可能的肿瘤抑制基因，位于染色体16q23.3-24.1区域，跨越了整个常见染色体脆性位点FRA16D。该脆性位点易在香烟等物质作用下发生基因变异。近年来的研究证明其表达缺失与乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关。本研究拟采用免疫组化方法检测WWOX蛋白在非小细胞肺癌中的表达，探讨其在非小细胞肺癌发生发展中的作用和预后意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料及标本来源

　　收集郑州大学第一、二附属医院2004-2007年胸外科手术切除并经病理确诊的原发性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)标本81例，其中男53例，女28例;年龄31-75岁，平均58岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗和其他治疗。术后迅速取癌组织及距癌组织边缘5 cm以上的正常肺组织，常规石蜡包埋。

　　1.2 免疫组织化学法检测WWOX蛋白的表达

　　兔抗鼠WWOX(28-42)多克隆抗体，购自Calbioehem公司。操作按SP免疫组织化学试剂盒说明书进行。采用UIP法染色，石蜡切片常规脱蜡至水，热抗原修复，抗WWOX多抗工作浓度1∶200，阳性着色定位于肿瘤细胞和(或)基质细胞胞质内，呈褐色颗粒。按统一判定标准：①阳性细胞面积占切片总面积的百分比进行记分，设0%-5%为0分，5%-25%为1分，25%-50%为2分，50%-75%为3分，75%-100%为4分;②按阳性细胞中染色的强度记分：弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。将上述两项之和相加，大于1的判定为阳性标本。阴性对照以PBS代替一抗。

　　1.3 统计学分析

　　所有数据用SPSS11.0软件进行统计处理。采用χ2检验、秩和检验，以α=0.05为差异有统计学意义的标准。

　　2 结 果

　　2.1 WWOX基因在肺癌组织和相应癌旁正常组织中的表达

　　WWOX蛋白主要在细胞胞质中表达，肺癌组织WWOX蛋白失表达率72.8%(59/81)，明显高于癌旁正常组织20%(4/20)，二者之间有高度显著性差异(P<0.01)。

　　2.2 WWOX蛋白表达与临床病理指标之间的关系

　　在非小细胞肺癌组织中，男性患者WWOX蛋白表达明显低于女性患者，鳞癌患者明显低于腺癌患者，低分化癌明显低于高分化癌，差异均有统计学意义(P<0.05)，但与年龄、临床分期无关(P>0.05，表1)。表1 WWOX蛋白的表达与NSCLC临床病理指标之间的关系(略)

　　3 讨 论

　　WWOX基因位于人类普通的染色体脆性位点，跨越微卫星体标记D16S515-D16S504，包含第二常见的脆性位点FRA16D(16q23.3-q24.1)，由9个外显子组成。Bdenarek等[2-4]测定FRA16D区域的序列，克隆出完整的cDNA和候选基因，命名为WWOX。编码含414个氨基酸的蛋白，其氨基末端的88个氨基酸与WW域蛋白家族的序列同源。

　　多项研究已经发现WWOX基因在实体瘤和细胞系中发生经常性缺失。Bednarek等[3-4]用Northern blotting和RT-PCR的方法检测到乳腺癌细胞系中有不同水平的WWOX表达，与细胞系的恶性程度呈负相关，高侵袭性的细胞系如MDA-MB-231和MDA-MB-435中WWOX低表达或基本检测不到，而低侵袭性的细胞系如MCF7和T47D相对高表达。

　　研究表明，WWOX基因的失活通常是由于4-8号外显子的异常拼接和等位基因的杂合性缺失、纯合性缺失和不常见的基因突变。肿瘤中最常见的表达是全长的WWOX mRNA和四个异常的mRNA拼接，野生型WWOX蛋白常常缺失，缺失并非由于DNA甲基化导致的转录沉默，而可能是调节WWOX启动子的转录活性发生了改变[5]。Paige等[6]研究证实WWOX在卵巢癌细胞系和其他肿瘤细胞系中纯合性缺失，失去WWOX基因编码酶的部分，从而影响肿瘤细胞的生长。

　　本研究表明，非小细胞肺癌组织中WWOX蛋白失表达率明显高于癌旁正常组织，即使非小细胞肺癌组织中有WWOX蛋白表达，表达强度也明显低于癌旁正常组织。提示WWOX基因表达下调可能在肺癌的发生发展中具有重要的作用，与Donati[7]的研究一致。

　　Pluciennik等[8]研究显示，WWOX基因在mRNA水平上的表达与乳腺癌患者的年龄及预后密切相关。本研究结果表明WWOX蛋白的失表达与非小细胞肺癌患者年龄、临床分期无关，但和组织分化程度有关。说明WWOX蛋白在一定程度上可以判断预后。

　　男性肺癌患者WWOX蛋白表达要明显低于女性，鳞癌显著低于腺癌。这可能是由于男性较女性与烟草关系更为密切所致。有研究显示，WWOX蛋白表达与雌激素受体表达密切相关[9]。这也可能是男性WWOX蛋白表达低于女性的原因。

　　【参考文献】

　　[1]董西林，张勇，谢明.环氧化酶-2及表皮生长因子受体在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2007, 28(3):276-278.

　　[2]Bednarek AK, Laflin KJ, Daniel RL, et al. WWOX, a novel WW domain-containing Protein mapping to human chromosome16q23.3-24.1, a region frequently affected in breast cancer [J]. Cancer Res, 2000, 60(8):2140-2145.

　　[3]Bednarek AK, Keck-Waggoner CL, Daniel RL, et al. WWOX, the FRA16D Gene, behaves as a suppressor of tumor growth [J]. Cancer Res, 2001, 61(22):8068-8073.

　　[4]Ried K, Finnis M, Hobson L, et al. Common chromosomal fragile site FRA16D sequence：identification of the FOR gene spanning FRA16D and homozygous deletions and translocation breakpoints in cancer cells [J]. Hum Mol Genet, 2000, 9(11):1651-1663.

　　[5]Kraemer-Pecore CM, Lecomte JT, Desjarlais JR. A de novo redesign of the WW domain [J]. Protein Sci, 2003, 12(10):2194-2205.

　　[6]Paige AJ, Taylor KJ, Taylor C, et al. WWOX: A candidate tumor suppressor gene involved in multiple tumor types [J]. Proc Natl Acad Sci, 2001, 98(20):11417-11422.

　　[7]Donati V, Fontanini G, Dell-Omodarme M, et al. WWOX expression in different histologic types and subtypes of non-small cell lung cancer [J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(3):884-891.

　　[8]Pluciennik E, Kusinska R, Potemski P, et al. WWOX-the FRA16D cancer gene: expression correlation with breast cancer progression and prognosis [J]. Eur J Surg Oncol, 2006, 32(2):153-157.

　　[9]Nunez MI, Ludes-Meyers J, Abba MC, et al. Frequent loss of WWOX expression in breast cancer: correlation with estrogen receptor status [J]. Breast Cancer Res Treat, 2005, 89(2):99-105.