NT4-Ant-Shepherdin［79-87］融合基因重组载体的构建

　　作者：汤小江，平宝华，潘承恩，杨广笑，王全颖 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 设计构建携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的cDNA融合基因的重组载体，为针对Survivin的靶向治疗奠定基础。方法 应用非对称引物/模板法、PCR技术制备NT4-Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片断，连接于pGEM-T-Easy载体，经克隆测序、酶切后与PBV220/NT4质粒连接;转化感受态细胞E.coli DH5α，亚克隆获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因。结果 克隆出Ant-Shepherdin[79-87]基因，经酶切及测序证实结果正确;连接PBV220/NT4，经克隆、酶切，琼脂糖凝胶电泳证实获得321 bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因片断。结论 通过分子生物学技术成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体，为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础

　　【关键词】 Survivin;Ant;神经营养因子4(NT4);融合基因;载体

　　Construction of recombinant vector containing

　　fusion gene NT4-Ant-Shepherdin[79-87]

　　Tang Xiaojiang, Ping Baohua, Pan Cheng’en, Yang Guangxiao, Wang Quanying

　　1. Department of Oncological Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061;

　　2. Department of Infection Control,the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061;

　　3. Department of Geratic Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an JiaotongUniversity, Xi’an 710061; 4. Xi’an Huaguang Bio-engineering Company, Xi’an 710025, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate survivin as an anticancer therapeutic target by use of shepherdin [79-87], a novel peptide carrying the survivin sequence from Lys-79 through Leu-87, we constructed an recombinant vector containing fusion gene NT4-Ant-Shepherdin [79-87]. Methods The gene of Ant-Shepherdin [79-87] was obtained by PCR and T-vector method. After cloned and digested with restricted enzyme, Ant-shepherdin [79-87] was inserted in PBV220/NT4 vector. The recombinant vector was transformed into the competent cell, E.coli DH5α. The fusion gene of NT4-Ant-Shepherdin [79-87] was identified by agarose gel electrophoresis (AGE). Results DNA sequencing results verified that the sequence of Ant-Shepherdin [79-87] was consistent with what we had designed. After transformed E.coli DH5α, a fragment of 321 bp was confirmed. Conclusion The recombinant vector containing fusion gene NT4-Ant-Shepherdin [79-87] was successfully constructed in this experiment by molecular biology techniques, which provides the basis of further research of survivin for cancer gene therapy.

　　KEY WORDS: survivin; Ant; NT4; fusion gene; vector

　　Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibition of apoptosis protein, IAP)家族的重要成员。1997年，耶鲁大学的Ambrosini等[1]在人类基因组文库中用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)的cDNA筛选克隆出来一个新基因，即Survivin，也称为凋亡抑制子4(API4)。Survivin基因位于人类17号染色体的q25区，全长14.7 kb。编码含142个氨基酸、分子质量为16.5 ku的胞质蛋白。研究表明，Survivin在大多数终末组织不表达，而在大多数实体瘤及血液系统肿瘤中呈现高表达[2]，具有凋亡抑制、参与细胞增殖及调节肿瘤血管生成等重要作用[3-5]。由于Survivin作为一个癌基因，交叉作用于多个细胞内网络系统，因而近年来针对Survivin进行了广泛的肿瘤靶向治疗研究，包括反义寡核苷酸、显负性突变体、核酶、小干扰RNA(SiRNA)、疫苗及免疫治疗、小分子拮抗物等[6]。最近的研究发现，肿瘤细胞Survivin的高表达同细胞内热休克蛋白90(Hsp90)高表达相关，升高的Survivin与Hsp90结合，保护Survivin不被泛素-蛋白酶体降解[7]。Survivin与Hsp90结合区位于其Lys-79至Leu-87区域，因而有研究者设计与其相同序列的9肽，命名为Shepherdin[79-87]。作为拮抗物，Shepherdin[79-87]竞争干扰Survivin与Hsp90结合，促进Survivin降解，具有很好的抗肿瘤效果，且无明显的毒副作用[8]。基于此，我们设计了包含细胞穿膜肽及信号肽功能的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因，希望通过该融合基因的构建，实现以Shepherdin为抗肿瘤目的肽的基因治疗。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　克隆载体pGEM-T-Easy质粒(50 μg/L)购自Promega公司;限制性内切酶NaeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司;pBV220-NT4质粒、大肠杆菌TOP10、E.coli DH5α菌株等由西安华广生物工程公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 融合基因Ant-Shepherdin[79-87]的设计 根据GenBank提供的人Survivin79-87位氨基酸序列KHSSGCAFL及细胞穿膜肽Ant(黑腹果蝇触足肽Antennapedia)的类似物氨基酸序列GRQVKVWFQNRRMKWKK设计融合序列，并根据哺乳动物偏爱密码子反翻译成基因序列。

　　1.2.2 引物设计与合成

　　采用非对称引物/模板法，设计正、负向引物/模板链，正向引物的5′端设计加入NaeⅠ酶切位点，负链引物的5′端加入终止子和BamHⅠ酶切位点。应用DNASIS计算机软件设计下列引物，引物/模板合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成，PAGE纯化。正向引物/模板F：5′-CGCCGGCGTGGGAAGAAGTGGAAGATGCGCCGGAATC-

　　AGTTCTGGGTAAAGGTAC;负向引物/模板R：5′-CGGATCCTCAAAGGAAAGCGCAACCGGACGAA-

　　TGCTTTCCGCGCTGTACCTTTACC。

　　1.2.3 cDNA克隆及序列分析

　　使用正、负向引物进行PCR扩增目的基因，反应条件为：94 ℃变性60 s，37 ℃退火60 s，72 ℃延伸80 s，循环30次，72 ℃延伸5 min。取5μL PCR反应产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。Ant-Shepherdin[79-87]基因片段连接入pGEM-T-Easy载体，将连接产物转化入感受态细菌TOP10菌株，用碱裂解法小量提取质粒，限制性内切酶EcoRⅠ酶切分析筛选pGEM-T/阳性克隆，部分送上海生工生物工程公司测序。

　　1.2.4 pBV220/NT4-Ant-Shepherdin[79-87]载体构建碱裂解法大量制备重组质粒pGEM-T/Ant-Shepherdin[79-87]，用限制性内切酶NaeⅠ彻底消化后再用BamHⅠ消化，凝胶电泳分离、透析带洗脱获取Ant-Shepherdin[79-87]，用T4 DNA连接酶连入带有相同末端、携带神经生长因子4(NT4)信号肽的质粒载体pBV220-NT4中;连接反应产物转化制备好的感受态细菌E.coli DH5α菌株，接种于含有氨苄青霉素的LB培养基内，37 ℃增殖培养后，碱裂解法小量提取质粒;用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ联合酶切鉴定，预期目标条带为321 bp，筛选出重组质粒pBV220/NT4-Ant-Shepherdin[79-87]。

　　2 结果

　　2.1 PCR产物

　　以互为模板的引物进行PCR，所得产物和PCR分子质量标准参照物相比较，在琼脂糖凝胶电泳上获得约100 bp的融合基因Ant-Shepherdin[79-87]基因片段，该值与理论值相符(图1)。

　　2.2 重组质粒pGEM-T/Ant-Shepherdin[79-87]的酶切鉴定

　　克隆构建的重组质粒命名为pGEM-T/Ant-Shepherdin[79-87]，大小为3 115 bp。经EcoRⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果可见100 bp的目的片段，与理论值相符，显示阳性重组质粒被完全切开，说明Ant-Shepherdin[79-87]已经重组于pGEM-T Easy内(图2)。

　　2.3 Ant-Shepherdin[79-87]嵌合肽cDNA片段核苷酸序列分析

　　从DNA测序结果找出Ant-Shepherdin[79-87]嵌合肽cDNA片段序列，应用DNAsis软件同根据GenBank所提供的序列而设计的嵌合基因序列比较，所克隆的Ant-Shepherdin[79-87]嵌合肽cDNA片段从NaeⅠ酶切位点起到终止密码子TAG全长共100 bp，序列完全一致。

　　2.4 pBV220/NT4-Ant-Shepherdin[79-87]重组质粒的酶切鉴定

　　克隆构建的重组质粒命名为pBV220/NT4-Ant-Shepherdin[79-87]，大小为3 906 bp。理论上经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ联合酶切后，应该产生3 666 bp和321 bp两个片段。10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见321 bp的目的片段，显示重组质粒大小、酶切片段大小和理论值一致，说明NT4信号肽与Ant-Shepherdin[79-87]已经成功嵌合(图3)。

　　3 讨论

　　Survivin在肿瘤组织中的表达特异性强、表达率高，具有调控细胞增殖、抗凋亡及促进血管生成的重要作用，使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。短时期内，多个靶向Survivin的策略快速得到证实，许多已进入临床研究阶段。在这些靶向治疗策略中，Survivin拮抗物提供了新的思路，导致与肿瘤生存有关的分子通道特异的失活，而且对不同类型的肿瘤都广泛适用。

　　Shepherdin[79-87]作为干扰Survivin与Hsp90结合的蛋白药物，已经证实其极佳的抗肿瘤效果，且无明显毒副反应。蛋白转导域(PTDs)，又称为细胞穿膜肽(CPPs)是新近发展起来的向细胞内快速输送外源性大分子或高极性分子的有效途径。常用的PTD有HIV TAT(47-57)、Antennapedia(43-58)、HSV VP22、多聚精氨酸及PTD-5等，均为富含精氨酸及赖氨酸的呈现阳离子的短肽，其介导的蛋白转导入活细胞的机制与一些内吞通道有关[9]。通过增加果蝇同源异构型转录因子的Ant(43-58)蛋白可以提高Shepherdin[79-87]的疗效，但仍存在生物半衰期短、易降解、生物利用率低、在体肿瘤难以达到有效剂量浓度、价格昂贵等不足，限制其应用前景。

　　研究发现，采用基因工程表达蛋白质和多肽，可以将外源基因克隆在一个合适的表达系统内，在合适的宿主细胞中进行转录、翻译、加工、分离纯化或转染哺乳动物细胞。这一过程中，通过将编码目的蛋白的基因序列融合到编码信号肽的DNA中不但可实现外源蛋白的分泌表达，防止宿主细胞对表达产物的降解及恢复表达产物天然构象，还可以使目的蛋白分泌出胞，杀伤毗邻的未转染的肿瘤细胞，扩大治疗效应。而目前对较短的生物活性肽进行分泌表达的研究有限，主要由于信号肽和目的短肽要保证连接后的序列与肽酶识别的氨基酸序列不变，才能被肽酶正确切割，使目的肽发挥应有的作用。我们实验室已成功地应用神经营养因子4(NT4)所含的信号肽和前导肽序列实现了真核细胞的分泌表达[10]。基于以上研究，本实验通过分子生物学技术，成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体，为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1]Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma [J]. Nat Med, 1997, 3(8):917-921.

　　[2]Altieri DC. Survivin, versatile modulation of cell division and apoptosis in cancer [J]. Oncogene, 2003, 22(53):8581-8589.

　　[3]Jiang X, Wilford C, Duensing S, et al. Participation of survivin in mitotic and apoptotic activities of normal and tumor-derived cells [J]. J Cell Biochem, 2001, 83(2):342-354.

　　[4]Skonfias DA, Mollinari C, Lacroix FB, et al. Human survivin is a kinetochore-associated passenger protein [J]. J Cell Biol, 2000, 151(7):1575-1582.

　　[5]Blanc-Brude OP, Mesri M, Wall NR, et al. Therapeutic targeting of the survivin pathway in cancer:initiation of mitochondrial apoptosis and suppression of tumor-associated angiogenesis [J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(6):2683-2692.

　　[6]Altieri DC. Targeted therapy by disabling crossroad signaling networks:the survivin paradigm [J]. Mol Cancer Ther, 2006, 5(3):478-482.

　　[7]Fortugno P, Beltrami E, Plecia J, et al. Regulation of survivin function by Hsp90 [J]. PNAS, 2003, 100(24):13791-13796.

　　[8]Plesia J, Salz W, Xia F, et al. Rational design of shepherdin, a novel anticancer agent [J]. Cancer Cell, 2005, 7(5):457-468.

　　[9]Richard JP, Melikov K, Brooks H, et al. Cellular uptake of unconjugated TAT peptide involves clathrin-dependent endocytosis and heparan sulfate receptors [J]. J Biol Chem, 2005, 280(15):15300-15306.

　　[10]杨宇，吴江，杨欣，等. NT4-NAP融合基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达[J]. 中华神经科杂志, 2004, 37(3):260-261.