应用siRNA技术下调survivin基因表达以增强SGC7901胃癌细胞对顺铂的敏感性

　　作者：丁瑾，孔庆兖 作者单位：(徐州医学院病理学教研室，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 利用小干扰RNA(siRNA)技术特异性下调survivin基因的表达，检测SGC7901胃癌细胞转染前后对顺铂敏感性的变化。方法 实验分为空白对照组(control组)、单用顺铂组(CDDP组)、脂质体组(Lip组)、单用survivin siRNA组(siRNA组)、转染survivin siRNA(转染组)及转染survivin siRNA联合顺铂作用组(联合作用组)。人工合成survivin siRNA，通过Lip包裹将siRNA转染胃癌细胞SGC7901，荧光显微镜下观察转染情况。MTT法检测各组细胞的增殖抑制率，Western blot及免疫细胞化学法检测survivin蛋白的表达，Hoechst染色观察细胞凋亡的形态改变。结果 Hoechst染色荧光显微镜下control组、Lip组及siRNA组细胞核呈正常的蓝色,而CDDP组、转染组及联合作用组细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变;联合作用组细胞增殖抑制率(63.93±4.22)%明显高于其余各组(P<0.05);转染组及联合作用组survivin蛋白表达明显低于其他各组(P<0.05)。结论 应用siRNA技术下调SGC7901胃癌细胞中survivin基因的表达，能够增加其对顺铂的药物敏感性。

　　【关键词】 survivin;siRNA;胃癌;顺铂

　　Enhanced sensitivity to cisplatin in human gastric carcinoma cell line SGC7901

　　by the downregulation of the survivin gene with siRNA technology

　　DING Jin， KONG Qingyan*

　　(Department of Pathology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract:Objective To detect the variations in cisplatin sensitivity of human gastric carcinoma cell line SGC7901 before and after transfection to specifically downregulate the expression of surviving gene with small interfering RNA (siRNA) technology.Methods This experiment is divided into the control group, cisplatin group (CDDP group), lipsome group (lip group), siRNA group, transfection group and siRNA combined CDDP group (combined group). Survivin siRNA was artificially synthesized and then transfected into gastric cancer cells with liposome. The transfection effects were determined by fluorescence microscopy. The inhibitory rate of cell proliferation was assayed by MTT, and the expression of survivin protein was determined by Western blot and immunocytochemical staining. The morphological changes of the apoptotic cells were observed by Hoechst staining.Results As observed under the fluorescence microscope after Hoechst staining, the nuclei presented as normal blue in the control group, lip group and siRNA group, while CDDP group, siRNA transfection group and siRNA combined cisplatin group had such changes as reinforced nuclear staining, karyopyknosis and karyorrhexis with apoptotic changes. The inhibition rate of cell proliferation in siRNA combined cisplatin group (63.93±4.22)% was markedly higher than the other groups (P<0.05). Compared with other groups, the expression of survivin protein in the transfection group and siRNA combined cisplatin group was significantly reduced, and the differences had statistical significance (P<0.05).Conclusion The application of siRNA technology to downregulate the survivin gene expression of human gastric carcinoma cell line SGC7901 is able to enhance its drug sensitivity to cisplatin.

　　Key words： survivin; siRNA; gastric carcinoma; cisplatin

　　顺铂是目前临床上最常用的化疗药物之一,其抗肿瘤作用明显、价格低廉，并且可应用于多种肿瘤的化疗,但是长期应用后极易出现耐受现象，降低其疗效,并且随着剂量的增加，出现的副作用越来越多。有研究表明,长期应用顺铂后，某些肿瘤细胞中出现耐药现象并且可检测到存活素(survivin)的高表达[1]。survivin是近年新发现的一种凋亡抑制因子，具有强大的抗凋亡功能，属于凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族成员之一。survivin与胃癌的定量研究表明，其表达量与患者的预后呈负相关。分化程度越低的胃癌组织中survivin表达率越高，患者预后越差[2]。因此，本实验通过将人工合成的survivin 小干扰RNA(siRNA)经脂质体(liposome,Lip)包裹后转染胃癌细胞SGC7901，探讨特异性地降低胃癌细胞SGC7901中survivin的表达能否增强该细胞对顺铂的化疗敏感性，从而为胃癌的化疗开辟一条新途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂 RPMI 1640购自美国GIBCO公司;胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品;LipfectamineTM 2000试剂盒及OPTIMEN转染液为Invitrogen公司产品，兔抗人survivin多克隆抗体购于Santa Cruz公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司，顺铂购自江苏豪森药业公司，稀释于RPMI 1640培养液中，终浓度为1 mg/L。

　　1.1.2 细胞株 人胃癌细胞株SGC7901，由徐州医学院病理学教研室保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组及细胞转染 实验分为空白对照组(control组)、单用顺铂组(CDDP组)、Lip组、单用survivin siRNA组(siRNA组)、转染survivin siRNA(转染组)及转染survivin siRNA联合顺铂作用组(联合作用组)，每组设4个复孔。各组作用SGC7901细胞72 h后进行相应后续试验。人胃癌细胞SGC7901常规培养至细胞融合约40%～70%时进行转染。用Optimem分别稀释脂质体和survivin siRNA至试验所需浓度并轻轻混匀，5 min后将survivin siRNA稀释液与Lip稀释液混匀，并在室温下放置30 min使之充分结合，加入细胞中，轻轻摇晃。37℃ 5% CO2温箱中培养，4～6 h后吸出，加入含10% FBS的RPMI 1640培养液。继续培养48 h后即可用于后续试验。

　　1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 实验分组同前，各组设4个复孔，分别收集转染及未转染细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，细胞贴壁后，根据分组加入所需试剂及药物。72 h后，每孔加入20 μl的MTT，继续培养4 h，弃上清，加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)室温振荡10 min后570 nm波长处测定光密度值(D570)。细胞抑制率(%)=(1-D570处理组/D570对照组)×100%。

　　1.2.3 免疫细胞化学检测survivin蛋白的表达 弃培养基，PBS冲洗2次，固定，再次PBS冲洗。根据SP9001试剂盒说明书进行操作，二氨基联苯胺(DAB)显色。survivin以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

　　1.2.4 Western blot法检测survivin蛋白的表达 收集各组细胞，用预冷的PBS洗涤2遍，加入细胞裂解液，冰浴30 min进行充分裂解。4℃低温离心机13 000 r/min离心5 min，取上清，Forlin酚法测蛋白浓度。100 μg/孔上样，进行12.5% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶和5%的积层胶电泳、转膜、封闭。分别加入一抗兔抗人survivin及β-actin多克隆抗体，4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG孵育2 h，四唑硝基蓝(NBT)/ 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)显色。一抗及二抗浓度均为1∶1 000，用图像分析系统测定各条带的灰度值，并用Image J图像分析软件分析。以β-actin为内参，表示survivin蛋白的相对表达强度。

　　1.2.5 Hoechst33258检测细胞凋亡形态 Hoechst33258染色：弃培养基，PBS冲洗2遍，固定，再次PBS冲洗。根据说明书进行染色。荧光显微镜下观察拍照。

　　1.3 统计学处理 用SPSS 13.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料采用±s表示，多个样本均数比较采用方差分析，两两比较用q检验，相关性检验用Pearson相关分析。P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 荧光显微镜下观察细胞形态 转染6 h后，出现绿色荧光，细胞碎片增多。见图1。

　　2.2 转染survivin siRNA后胃癌细胞SGC7901对顺铂敏感性的影响 MTT法检测发现CDDP组、转染组及联合作用组对SGC7901细胞的增殖有较明显的抑制作用。其中联合作用组的细胞增殖抑制率最高，与其余各组相比差异有显著性(P<0.05)。见表1。图1 绿色荧光蛋白FITC标记siRNA转染

　　SGC7901细胞(×400)

　　2.3 转染前后细胞中survivin蛋白表达水平的改变

　　2.3.1 免疫细胞化学检测结果 与control组、lip组、siRNA组和CDDP组相比,转染后细胞中survivin蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图2、表2。表1 Survivin siRNA对SGC7901细胞增殖的抑制作用表2 各组SGC7901细胞survivin蛋白的表达与其余各组比较：#、*P<0.05;与CDDP组比较：△P<0.05

　　2.3.2 Western blot法检测结果 转染组survivin蛋白的表达明显低于其余各组(P<0.05);CDDP组作用细胞72 h后，survivin蛋白的表达明显高于其余各组(P<0.05)。见表3。

　　2.4 转染前后对细胞凋亡的影响 Honchest33258染色显示control组、Lip组和siRNA组细胞的细胞核完整，呈正常的蓝色;CDDP组、转染组及联合作用组细胞的细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂，呈凋亡改变。表3 各组SGC7901细胞中survivin蛋白的D值与其余各组比较：#P<0.05;与CDDP组比较：*P<0.05

　　3 讨 论

　　胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,世界胃癌发病率为13.86/10万,仅次于肺癌居恶性肿瘤的第2位。在我国胃癌的发病率及死亡率均居恶性肿瘤之首,每年死于胃癌者达16万人,占全部恶性肿瘤死亡人数的23%。由于胃癌早期诊断率较低，而进展期胃癌单纯根治手术年生存率仅40%，即使扩大切除范围的超根治术也未明显提高生存率，因此，目前临床上化疗对于胃癌的治疗具有重要意义。顺铂由于其抗肿瘤作用明显、价格低廉，并且可应用于多种肿瘤的化疗，是目前临床最常用的化疗药物之一，在肿瘤的治疗中占有重要地位。但是长期运用顺铂会造成机体对其敏感性降低，从而严重影响了化疗效果，并且降低了患者的生存率。

　　survivin直接作用于caspase，主要通过抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7或干扰caspase-9的活性，阻断细胞凋亡的共同通路。而顺铂也是通过caspase-3依赖的信号传导途径，诱导肿瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤细胞的生长，从而达到抗肿瘤的效果[3]。并且有研究显示，在耐顺铂的人胃癌细胞中，survivin表达明显高于普通人的胃癌细胞[4]。因此，我们认为降低肿瘤细胞中survivin的表达可能能够增强肿瘤细胞对顺铂的药物敏感性。

　　本实验采用RNA干扰(RNA interference， RNAi)技术特异性的降低survivin在SGC7901中的表达。RNAi技术是利用双链RNA(dsRNA)能够特异性地降解具有同源序列的mRNA，特异性地阻断相应基因的表达，从而成为近年来较为热门的一种研究基因功能和进行基因治疗的新方法[5]。RNAi在胞质dsRNA特异性核酸内切酶(Dicer)的作用下裂解成为具有21～23nt碱基的短片段dsRNA分子，称之为siRNA，siRNA与核酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),RISC通过碱基配对方式与同源靶向mRNA结合后，从siRNA的3′端将靶mRNA切割成小于12nt的片段并使其降解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制[6]。与传统的基因治疗方法相比，RNAi技术具有特异、高效和毒性小的特点，有着明显的优势。

　　本研究采用脂质体包裹survivin siRNA转染SGC7901细胞6 h后，荧光显微镜下可以看见绿色荧光，出现细胞碎片，并且转染后的细胞survivin蛋白的表达明显降低。联合作用组Honchest染色可见SGC7901细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂，呈凋亡改变的细胞明显多于CDDP组。而转染后顺铂对SGC7901的细胞增殖抑制率从转染前的(42.97±2.73)%提高到(63.93±4.22)%。

　　本实验结果显示，通过RNAi技术特异性地下调胃癌SGC7901细胞中survivin的表达，能够明显增加SGC7901对顺铂的敏感性，增强顺铂对细胞的杀伤作用，从而为临床治疗胃癌提供了一个新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Zaffaroni N, Daidone MG. Survivin expression and resistance to anticancer treatment: perspectives for new therapeutic interventions [J]. Drug Resist Updat, 2002, 5(2):65-72.

　　[2] 张宏,韩大正,徐丽. Survivin蛋白在胃癌中的表达及临床意义 [J].中原医刊，2007,34(9):38-39.

　　[3] De Santis M, Bachner M. New development in first-and-second line chemotherapy for transitional cell, squamous cell adenocarcinoma of the bladder [J]. Curr Opin Urol, 2007, 17(5):363-368.

　　[4] Nakamura M, Tsuji N, Asanuma K, et al. Survivin as a predictor of cis-diamminedichloroplatinum sensitivity in gastric cancer patients [J]. Cancer Sci,2004,95(1):44-51.

　　[5] Kretschmer-Kazemi Far R, Sczakiel G. The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: a comparison with antisense oligonucleotides [J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(15):4417-4424.

　　[6] Ait-Si-Ali S, Guasconi V, Harel-Bellan A. RNA interference and its possible use in cancer therapy[J]. Bull Cancer,2004,91(1):15-18.