肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究

　　作者：周乐，和平，王艳，屈建强，王一理 作者单位：西安交通大学：1. 医学院第二附属医院神经外科，陕西西安 710004;2. 医学院第二附属医院呼吸内科，陕西西安 710004;3. 生物医学信息工程教育部重点实验室，生命科学与技术学院癌症研究所，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 探讨肿瘤间质灌注液蛋白质组作为分析肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组的可能性。方法 应用PBS液孵育新鲜肿瘤组织，提取肿瘤间质灌注液中的总蛋白，并应用蛋白质组学技术对其进行分析研究。结果 应用双向电泳、质谱和生物信息技术成功分离并鉴定出肿瘤间质灌注液中的蛋白成分;在肿瘤间质灌注液中发现肿瘤分泌蛋白Profilin1。结论 肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究为研究肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组提供了新的研究方案。

　　【关键词】 肿瘤间质灌注液 微环境 蛋白质组

　　Proteomicsbased analysis of tumor interstitial perfusing fluid

　　ZHOU Le, HE Ping, WANG Yan, QU Jianqiang, WANG Yili

　　1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;3. the Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education,Institute for Cancer Research, School of Life Science & Technology,Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To observe the possibility that the proteomics of the tumor interstitial perfusing fluid can be analyzed as the tumor microenvironment proteomics. Methods Clean fresh tumor tissue biopsies were incubated in phosphate buffered saline (PBS). The tumor microenvironment proteins were extracted in perfusing fluid and then analyzed by proteomics technique. Results The proteins in tumor interstitial perfusing fluid were analyzed by twodimensional gel electrophoresis (2DE), Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS) and bioinformatics; one of the proteins was identified as secreted protein Profilin1. Conclusion The tumor interstitial perfusing fluid proteomics can be analyzed as the tumor microenvironment proteomics.

　　KEY WORDS: tumor perfusing fluid; microenvironment; proteomics

　　恶性肿瘤侵袭性生长的特点使手术无法全切肿瘤，这也是胶质瘤等恶性肿瘤目前治疗效果不佳的原因之一。已知恶性肿瘤细胞的生长特性不仅与肿瘤细胞自身有关，瘤周微环境对肿瘤细胞的生长行为亦有重要影响。然而，以往研究主要集中于对肿瘤细胞或组织本身，或肿瘤微环境中个别蛋白分子的研究，而很少有针对性地关注肿瘤细胞微环境中各种蛋白分子的整体组成和变化。随着蛋白质组学技术的成熟，系统而全面地分析组织蛋白组成已成为可能。近日，我们建立了肿瘤间质灌注液的蛋白质组学研究平台，为日后进一步对各种恶性肿瘤以及胶质瘤微环境中的蛋白组成及变化进行研究鉴定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Ettan IPGphor等电聚焦系统、Hoefer SE600垂直电泳系统、Umax Image Scanner扫描仪、图像分析软件Image Master 2D Elite 5.0、固定pH梯度(IPG)胶条(pH 4～7L)、IPG缓冲液，银染试剂盒、图像分析软件Image Master 5.0均购自Amersham Biosciences公司;VoyagerDE MALDITOF质谱仪购自美国ABI公司;CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、测序级的TPCK胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、αcyano4hydroxycinnamic acid(CHCA)购于Sigma公司。实验中所有用水均为milliQ水。

　　1.2 方法

　　新鲜乳腺癌转移淋巴结癌组织在离体后迅速置于冰上，20min内送至实验室进行后续实验。取大约0.25g新鲜干净肿瘤组织标本，切成直径大约1～3mm的小组织块。PBS冲洗组织表面残留血迹，37℃、0.8mL PBS湿化培养箱中孵育组织块1h;4℃下取孵育液1000r/min离心2min，取上清5000r/min再次离心20min，所得上清为肿瘤间质灌注液。

　　取含80μg蛋白质的灌注液样本，加4倍体积-20℃预冷的丙酮，混匀后，-20℃静置3h，13000r/min离心10min，去上清，留沉淀室温干燥后备用。

　　双向凝胶电泳参照ZHOU等[1]的方法进行。将160μg蛋白质在13cm pH 4～7L的IPG胶条上行等电聚焦电泳。聚焦完成，胶条经平衡后进行SDSPAGE第二向电泳。待2DE结束之后，对所得凝胶依次进行银染、图像扫描和分析。

　　质谱分析方法为随机选择一蛋白点a依次进行胶内酶解、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)分析，获蛋白点a的肽质量指纹图谱，并应用Mascot软件在Swissprot蛋白库中对蛋白进行鉴定[2]。

　　2 结 果

　　应用双向凝胶电泳技术，在肿瘤间质灌注液中分离得到数百种蛋白质(图1)。这说明肿瘤间质灌注液含大量蛋白信息。之后随机选取蛋白点a顺序进行胶内酶解以及MALDITOF MS检测，得蛋白点a肽指纹图谱(图2)。依据该肽指纹图谱在数据库中检索，首选蛋白Profilin1评74分，符合Mascot软件统计学标准(P<0.05)。最终蛋白a被确认为Profilin1蛋白(图3)。

　　3 讨 论

　　肿瘤的生长和进展既依赖于肿瘤细胞的恶性程度，也依赖于肿瘤细胞与局部微环境中所有细胞(包括肿瘤细胞、体细胞、内皮细胞和免疫炎性细胞等)所产生因子的相互间作用。而这种相互作用在同一肿瘤内部可能随时间或空间的改变而改变。

　　已知信息表明，肿瘤细胞分泌因子可改变成纤维细胞在基质上的活性，反过来成纤维细胞分泌的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白和细胞因子可以影响肿瘤细胞的生物特性和活性。此外，体细胞分泌的蛋白酶容易促使组织降解、癌细胞移动和转移[3]。其他肿瘤微环境中的非瘤细胞类型包括内皮细胞和他们的支撑细胞(周细胞)、炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)、M细胞(mast cells)、免疫细胞(淋巴细胞)、平滑肌细胞、肌上皮细胞和脂肪细胞，所有这些细胞都被认为可以不同程度地影响肿瘤细胞的生物学特性[4]。例如，到目前为止，已经发现许多蛋白在乳腺癌肿瘤微环境中起调节作用，如雌激素、黄体酮受体、基质金属蛋白酶(MMPs)如间质性胶原酶、白明胶酶、基质溶解酶、膜型基质金属蛋白酶[5]和尿激酶型血浆酶原受体等，其中许多蛋白已成为肿瘤治疗的可选靶点。对于复发胶质瘤来说，还有一个重要的特点就是肿瘤性质可能较前进一步恶化，病理学分级升高，这一变化过程是否与微环境变化因素有关，还无定论。所以要全面了解肿瘤细胞的生物学行为，除了要对肿瘤细胞本身进行深入研究外，还应着眼于肿瘤所处微环境对肿瘤细胞生物学行为的影响。

　　大量文献表明细胞膜表面囊泡的脱落是正常细胞和肿瘤细胞向外界释放蛋白的主要机制。已知细胞通过囊泡释放的蛋白主要包括基质降解蛋白酶(matrixdegrading proteinases)[6]、组织蛋白酶B[7]、BRCA1[8]、IL1β[9]、成纤维细胞生长因子2[10]和肿瘤相关表面抗原[11]。且已经证明，这些分泌的蛋白影响着肿瘤的微环境并在细胞与细胞、细胞与基质的相互作用、侵袭、血管形成、转移以及免疫逃逸方面均扮演重要角色。由此可见，肿瘤细胞微环境中含有大量与肿瘤生物学行为有关的蛋白分子，对他们的深入研究将帮助我们更好地理解肿瘤的一些诸如侵袭性生长等生物学问题，同时也是对肿瘤细胞蛋白质组学研究的重要补充。

　　以往对细胞分泌蛋白的研究大部分以体外细胞培养液中蛋白的变化为研究对象。因细胞所处的环境变化，这种模型往往不能真实反映细胞在体时的真实情况。我们利用短时孵育离体组织的方法获得的肿瘤间质灌注液在一定程度上更能反映出自然情况下肿瘤间质中的蛋白组成及变化。

　　实验中利用PBS液提取肿瘤组织中各种细胞的分泌蛋白，然后对其所含蛋白进行了2DE分离，最终获得较为满意的2DE图谱。说明应用PBS提取的肿瘤组织间质灌洗液中含有大量蛋白信息，其中蛋白点a最后被确定为蛋白Profilin1。非常有趣的是，最近GRONBORG等[12]同样应用蛋白质组学方法分析培养的胰腺癌细胞分泌蛋白质组时发现，胰腺癌细胞培养液中也存在Profilin1蛋白。这也就从侧面证实，肿瘤间质灌注液中包含肿瘤组织的分泌蛋白，肿瘤间质灌注液可作为肿瘤组织细胞微环境蛋白质组研究的途径之一。

　　总之，肿瘤间质灌注液蛋白组作为分析肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组，是从全新的角度来探讨肿瘤的某些生物学特征。该技术平台的建立为肿瘤微环境分子机制的研究提供了新的思路和方法，并可能为肿瘤的早期诊断及治疗提供新的研究线路。

　　【参考文献】

　　Proteomicsbased analysis of tumor interstitial perfusing fluid

　　ZHOU Le, HE Ping, WANG Yan, QU Jianqiang, WANG Yili

　　1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;3. the Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education,Institute for Cancer Research, School of Life Science & Technology,Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To observe the possibility that the proteomics of the tumor interstitial perfusing fluid can be analyzed as the tumor microenvironment proteomics. Methods Clean fresh tumor tissue biopsies were incubated in phosphate buffered saline (PBS). The tumor microenvironment proteins were extracted in perfusing fluid and then analyzed by proteomics technique. Results The proteins in tumor interstitial perfusing fluid were analyzed by twodimensional gel electrophoresis (2DE), Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS) and bioinformatics; one of the proteins was identified as secreted protein Profilin1. Conclusion The tumor interstitial perfusing fluid proteomics can be analyzed as the tumor microenvironment proteomics.

　　KEY WORDS: tumor perfusing fluid; microenvironment; proteomics

　　恶性肿瘤侵袭性生长的特点使手术无法全切肿瘤，这也是胶质瘤等恶性肿瘤目前治疗效果不佳的原因之一。已知恶性肿瘤细胞的生长特性不仅与肿瘤细胞自身有关，瘤周微环境对肿瘤细胞的生长行为亦有重要影响。然而，以往研究主要集中于对肿瘤细胞或组织本身，或肿瘤微环境中个别蛋白分子的研究，而很少有针对性地关注肿瘤细胞微环境中各种蛋白分子的整体组成和变化。随着蛋白质组学技术的成熟，系统而全面地分析组织蛋白组成已成为可能。近日，我们建立了肿瘤间质灌注液的蛋白质组学研究平台，为日后进一步对各种恶性肿瘤以及胶质瘤微环境中的蛋白组成及变化进行研究鉴定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Ettan IPGphor等电聚焦系统、Hoefer SE600垂直电泳系统、Umax Image Scanner扫描仪、图像分析软件Image Master 2D Elite 5.0、固定pH梯度(IPG)胶条(pH 4～7L)、IPG缓冲液，银染试剂盒、图像分析软件Image Master 5.0均购自Amersham Biosciences公司;VoyagerDE MALDITOF质谱仪购自美国ABI公司;CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、测序级的TPCK胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、αcyano4hydroxycinnamic acid(CHCA)购于Sigma公司。实验中所有用水均为milliQ水。

　　1.2 方法

　　新鲜乳腺癌转移淋巴结癌组织在离体后迅速置于冰上，20min内送至实验室进行后续实验。取大约0.25g新鲜干净肿瘤组织标本，切成直径大约1～3mm的小组织块。PBS冲洗组织表面残留血迹，37℃、0.8mL PBS湿化培养箱中孵育组织块1h;4℃下取孵育液1000r/min离心2min，取上清5000r/min再次离心20min，所得上清为肿瘤间质灌注液。

　　取含80μg蛋白质的灌注液样本，加4倍体积-20℃预冷的丙酮，混匀后，-20℃静置3h，13000r/min离心10min，去上清，留沉淀室温干燥后备用。

　　双向凝胶电泳参照ZHOU等[1]的方法进行。将160μg蛋白质在13cm pH 4～7L的IPG胶条上行等电聚焦电泳。聚焦完成，胶条经平衡后进行SDSPAGE第二向电泳。待2DE结束之后，对所得凝胶依次进行银染、图像扫描和分析。

　　质谱分析方法为随机选择一蛋白点a依次进行胶内酶解、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)分析，获蛋白点a的肽质量指纹图谱，并应用Mascot软件在Swissprot蛋白库中对蛋白进行鉴定[2]。

　　2 结 果

　　应用双向凝胶电泳技术，在肿瘤间质灌注液中分离得到数百种蛋白质(图1)。这说明肿瘤间质灌注液含大量蛋白信息。之后随机选取蛋白点a顺序进行胶内酶解以及MALDITOF MS检测，得蛋白点a肽指纹图谱(图2)。依据该肽指纹图谱在数据库中检索，首选蛋白Profilin1评74分，符合Mascot软件统计学标准(P<0.05)。最终蛋白a被确认为Profilin1蛋白(图3)。

　　3 讨 论

　　肿瘤的生长和进展既依赖于肿瘤细胞的恶性程度，也依赖于肿瘤细胞与局部微环境中所有细胞(包括肿瘤细胞、体细胞、内皮细胞和免疫炎性细胞等)所产生因子的相互间作用。而这种相互作用在同一肿瘤内部可能随时间或空间的改变而改变。

　　已知信息表明，肿瘤细胞分泌因子可改变成纤维细胞在基质上的活性，反过来成纤维细胞分泌的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白和细胞因子可以影响肿瘤细胞的生物特性和活性。此外，体细胞分泌的蛋白酶容易促使组织降解、癌细胞移动和转移[3]。其他肿瘤微环境中的非瘤细胞类型包括内皮细胞和他们的支撑细胞(周细胞)、炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)、M细胞(mast cells)、免疫细胞(淋巴细胞)、平滑肌细胞、肌上皮细胞和脂肪细胞，所有这些细胞都被认为可以不同程度地影响肿瘤细胞的生物学特性[4]。例如，到目前为止，已经发现许多蛋白在乳腺癌肿瘤微环境中起调节作用，如雌激素、黄体酮受体、基质金属蛋白酶(MMPs)如间质性胶原酶、白明胶酶、基质溶解酶、膜型基质金属蛋白酶[5]和尿激酶型血浆酶原受体等，其中许多蛋白已成为肿瘤治疗的可选靶点。对于复发胶质瘤来说，还有一个重要的特点就是肿瘤性质可能较前进一步恶化，病理学分级升高，这一变化过程是否与微环境变化因素有关，还无定论。所以要全面了解肿瘤细胞的生物学行为，除了要对肿瘤细胞本身进行深入研究外，还应着眼于肿瘤所处微环境对肿瘤细胞生物学行为的影响。

　　大量文献表明细胞膜表面囊泡的脱落是正常细胞和肿瘤细胞向外界释放蛋白的主要机制。已知细胞通过囊泡释放的蛋白主要包括基质降解蛋白酶(matrixdegrading proteinases)[6]、组织蛋白酶B[7]、BRCA1[8]、IL1β[9]、成纤维细胞生长因子2[10]和肿瘤相关表面抗原[11]。且已经证明，这些分泌的蛋白影响着肿瘤的微环境并在细胞与细胞、细胞与基质的相互作用、侵袭、血管形成、转移以及免疫逃逸方面均扮演重要角色。由此可见，肿瘤细胞微环境中含有大量与肿瘤生物学行为有关的蛋白分子，对他们的深入研究将帮助我们更好地理解肿瘤的一些诸如侵袭性生长等生物学问题，同时也是对肿瘤细胞蛋白质组学研究的重要补充。

　　以往对细胞分泌蛋白的研究大部分以体外细胞培养液中蛋白的变化为研究对象。因细胞所处的环境变化，这种模型往往不能真实反映细胞在体时的真实情况。我们利用短时孵育离体组织的方法获得的肿瘤间质灌注液在一定程度上更能反映出自然情况下肿瘤间质中的蛋白组成及变化。

　　实验中利用PBS液提取肿瘤组织中各种细胞的分泌蛋白，然后对其所含蛋白进行了2DE分离，最终获得较为满意的2DE图谱。说明应用PBS提取的肿瘤组织间质灌洗液中含有大量蛋白信息，其中蛋白点a最后被确定为蛋白Profilin1。非常有趣的是，最近GRONBORG等[12]同样应用蛋白质组学方法分析培养的胰腺癌细胞分泌蛋白质组时发现，胰腺癌细胞培养液中也存在Profilin1蛋白。这也就从侧面证实，肿瘤间质灌注液中包含肿瘤组织的分泌蛋白，肿瘤间质灌注液可作为肿瘤组织细胞微环境蛋白质组研究的途径之一。

　　总之，肿瘤间质灌注液蛋白组作为分析肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组，是从全新的角度来探讨肿瘤的某些生物学特征。该技术平台的建立为肿瘤微环境分子机制的研究提供了新的思路和方法，并可能为肿瘤的早期诊断及治疗提供新的研究线路。