Celecoxib对乳腺癌MCF7细胞增殖和凋亡的影响

　　作者：代志军，王西京，刘小旭，康华峰，管海涛，刁 岩，闵卫利，马小斌 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院肿瘤科，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 探讨选择性环氧化酶2(cyclooxygenase2, COX2)抑制剂Celecoxib对乳腺癌MCF7细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 用不同浓度(10、20、40μmol/L)的Celecoxib处理MCF7细胞，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Celecoxib对MCF7细胞增殖的影响;流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡;RTPCR法检测COX2基因表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测前列腺素E2(PGE2)释放水平。结果 Celecoxib对乳腺癌MCF7细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性;Celecoxib可下调MCF7细胞COX2 mRNA表达。流式细胞仪结果显示：细胞周期各时相中，Celecoxib各浓度组G0/G1期阻滞，S期细胞所占的比例明显减少，有明显的诱导凋亡作用。Celecoxib可明显抑制MCF7细胞PGE2释放水平。结论 Celecoxib可有效抑制乳腺癌细胞增殖，并诱导凋亡。其机制可能与COX2表达下调、PGE2水平下降有关。

　　【关键词】 乳腺癌;环氧化酶;塞来昔布;细胞凋亡

　　human breast cancer cell line MCF7DAI Zhijun, WANG Xijing, LIU Xiaoxu, KANG Huafeng,

　　GUAN Haitao, DIAO Yan, MIN Weili, MA Xiaobin

　　(Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effects of selective cyclooxygenase2 inhibitor Celecoxib on proliferation and apoptosis of breast cancer MCF7 cells. Methods MTT assay was used to examine the proliferation of MCF7 cells treated by different concentration of Celecoxib after 24～96h. Flow cytometry was performed to analyze the apoptosis and cell cycle of MCF7 cells. The expression of COX2 was measured by RTPCR method and levels of PGE2 were measured by ELISA method. Results The inhibition of proliferation of MCF7 cells in vitro by Celecoxib was observerd in time and dosedependent manners. Celecoxib effectively downregulated the expression of COX2. The cell cycle was arrested at G0/G1, and rate of cells in S phase was obviously decreased. Celecoxib of different concentration could also induce apoptosis, and the apoptosis rate was related to the concentration of Celecoxib. Levels of PGE2 were inhibited by Celecoxib. Conclusion Celecoxib inhibits proliferation and induces apoptosis of MCF7 cells. The mechanism may be associated with downregulation of the expression of COX2 and inhibition of PGE2.

　　KEY WORDS: breast cancer; cyclooxygenase; Celecoxib; apoptosis

　　近几年来，流行病学、动物学实验以及环氧化酶2(cyclooxygenase2, COX2)在乳腺癌组织中的表达等多方面证据[13]表明，COX2与肿瘤的发生和进展有关，而且非甾体类抗炎药物通过抑制COX2表达而具有防治肿瘤的作用。但目前COX2 抑制剂在肿瘤发生发展过程中的具体作用尚不十分清楚。本研究旨在探讨COX2选择性抑制剂Celecoxib对人乳腺癌MCF7细胞增殖和凋亡的影响及机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂 人乳腺癌MCF7细胞株购自第四军医大学实验中心。小牛血清(Gibco, USA);RPMI1640培养基(Gibco, USA);四甲基偶氮唑盐(microculture tetrazolium, MTT)(Gibco, USA);碘化丙啶(propidiumiodide, PI) (Sigma公司, USA);RTPCR试剂盒(Ampliqon公司，丹麦);Trizol (Invitrogen, USA);Celecoxib(辉瑞制药公司);前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒(上海晶美生物公司);流式细胞仪(Becon Dickinson Facsalibur公司, USA)。

　　1.2 细胞培养和传代 MCF7细胞在含100mL/L小牛血清、1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI 1640完全培养基中，37℃、50mL/L CO2、饱和湿度孵箱培养。待细胞生长呈单层铺满瓶底时，用2.5g/L的胰蛋白酶与0.2g/L EDTA按1∶1混合，消化传代。按药物浓度分为空白组、Celecoxib 10μmol/L组、Celecoxib 20μmol/L组、Celecoxib 40μmol/L组共4组。

　　1.3 MTT法检测不同浓度Celecoxib对MCF7细胞增殖的影响 选取对数生长期的MCF7细胞，经胰酶消化、台盼蓝染色后在血细胞计数板上计数，确保活细胞>97%。调整细胞浓度为每孔5×103个(每孔100μL)，加到96孔培养板中，在37℃、50mL/L CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度(10、20、40μmol/L)Celecoxib，每个浓度设5个复孔;同时设置空白对照组和调零孔。继续培养6h，每孔加入50g/L MTT 20μL，再孵育4h。吸出上清液，加入200μL二甲基亚砜(DMSO)。在平板摇床摇10min，用酶标仪测490nm波长处每孔的吸光度(A值)。按下式计算细胞活力并以细胞活力对药物浓度绘制曲线。细胞活力=(实验组A值/对照组A值)×100%。

　　1.4 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率 取对数生长期的细胞，常规消化，制成单细胞悬液。计数并均以1×105/mL接种于6个50cm底面积的培养瓶中，分别加入不同浓度(10、20、40μmol/L)Celecoxib，常规培养48h后，收获细胞，制成单细胞悬液，将细胞悬液加入离心管中，800r/min离心5min，弃掉离心管中上清;以冰PBS缓冲液漂洗两遍，沿管壁缓慢加入750mL/L的冰乙醇固定，4℃过夜;测试前用PBS液洗去乙醇，离心除去上清，每管加入100mg/L RNA酶1mL，置于37℃孵箱中30min;然后每管中加入0.125μg/L碘化丙啶1mL标记，低温(2～8℃)避光静置30min，上流式细胞仪进行检测分析，实验重复5次。以DNA直方图上出现的G1期前的细胞凋亡峰所占细胞总数的比例计算凋亡率。

　　1.5 RTPCR检测MCF7细胞COX2 mRNA的表达 MCF7细胞按1×106个/瓶接种于100mL培养瓶中，孵育24h待细胞贴壁后加药。Celecoxib按0、10、20、40μmol/L浓度梯度分别处理24h。收集细胞用Trizol提取总RNA。取1μg RNA经逆转录酶在下列条件下合成cDNA：70℃ 5min，42℃延伸60min，95℃酶灭活3min，4℃终止反应。然后用该cDNA作为模板进行PCR反应，PCR引物由Invitrogen公司合成。COX2引物序列：5′ATCCTTGCTGTTCCCACCA3′(sense)和5′CTTTGACACCCAAGGGAGT3′(antisense)，扩增片段为285bp，退火温度为55℃(35个循环)。内对照β肌动蛋白(βactin)引物序列：5′GTTGCGTTACACCCTTTCTG3′(sense)，5′TGCTGTCACCTTCACCGTTC3′(antisense)，扩增片段为133bp，退火温度为55℃(40个循环)。扩增条件如下：95℃预变性3min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s进行相应循环次数。PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统作密度指数分析。COX2 mRNA相对表达量的判定：以COX2 mRNA电泳条带密度指数与相对的内参照βactin密度指数之比来表示。

　　1.6 ELISA法检测MCF7细胞前列腺素E2(PGE2)释放水平 以每孔4.0×105个细胞接种于6孔板，贴壁后分别加入不同浓度的Celecoxib(0、10、20、40μmol/L)孵育24h，收集上清。取0.5mL上清加入0.1mL HCl，离心10min收集上清，再加入0.1mL NaOH以中和酸性化的样品。将200μL标准品或样品分别加入相应孔中，操作步骤按PGE2 ELISA试剂盒要求进行。在酶联免疫检测分析仪上测定450nm A值，不加样品的孔用于调零，每一标准品及样品均设置复孔，实验重复3次。

　　1.7 统计学处理 数据以±s表示，应用SPSS10.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，两样本均数比较采用成组t检验，相关性分析采用Spearman法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度Celecoxib对MCF7细胞增殖的抑制作用 不同浓度(10、20、40μmol/L)的Celecoxib均可抑制MCF7细胞增殖(图1)，而且Celecoxib对乳腺癌MCF7细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性(oneway ANOVA test, P<0.05)。

　　2.2 半定量RTPCR法检测Celecoxib对MCF7细胞COX2 mRNA表达的影响 RTPCR结果显示，未经Celecoxib处理的MCF7细胞中COX2 mRNA水平较高，随着Celecoxib浓度增高，COX2 mRNA表达水平逐渐降低(图2)。

　　2.3 Celecoxib对MCF7细胞凋亡的诱导作用 不同浓度(10、20、40μmol/L)的Celecoxib均可诱导MCF7细胞发生凋亡，凋亡细胞百分数分别为(9.44±2.56)%、(21.54±3.52)%和(35.57±4.86)%，而对照组几乎检测不到凋亡细胞(1.62±1.14)%。细胞凋亡率与药物浓度呈正相关(r=0.864，P<0.01，图3)。

　　2.4 Celecoxib对MCF7细胞周期的影响 流式细胞仪结果显示：细胞周期各时相中，Celecoxib各浓度组出现G0/G1期阻滞，G0/G1期细胞所占的比例明显增多，S期细胞明显减少，与对照组相比均有显著性差异(P<0.05);Celecoxib大剂量(40μmol/L)组G2/M期细胞也有明显减少(表1)。

　　2.5 ELISA法检测Celecoxib对MCF7细胞PGE2释放水平的影响 不同浓度(10、20、40μmol/L)的Celecoxib可明显抑制MCF7细胞PGE2释放水平，其值分别为(58.15±6.56)ng/L、(42.84±6.12)ng/L和(28.65±4.33)ng/L，与对照组(75.32±8.73)ng/L比较差异有显著性(P<0.01，图4)。

　　3 讨 论

　　COX2是炎症过程中一个重要的诱导酶，催化合成PGs。但近几年来，国外诸多研究表明，COX2参与了肿瘤的发生发展，在许多肿瘤中过度表达，其中包括胃肠道肿瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等，而其抑制剂则具有防治肿瘤的作用[18]。

　　流行病学研究表明，同时抑制COX1和COX2的非类固醇类抗炎药(NSAIDs)减少乳腺癌的发病率。最近一项研究说明服用NSAIDs 5～9年乳腺癌发病率减少21%，使用10年或10年以上发病率能减少28%[1]。本研究中MTT结果显示：随着选择性COX2 抑制剂Celecoxib浓度的增加和时间的延长，乳腺癌细胞存活率逐渐降低。

　　COX2在乳腺癌发生发展过程中的具体作用尚不十分清楚，从已有的研究来看，主要表现在以下几个方面：前列腺素刺激细胞增殖，同时抑制免疫[4];COX2过度表达促进肿瘤新生血管生成[3];增加肿瘤细胞侵袭力，抑制肿瘤细胞凋亡[5];COX2与表皮生长因子受体2(HER2)在乳腺癌中存在协同表达，可能是通过HER2通路参与乳腺癌的癌变过程[67];而且COX2 抑制剂可以增加化疗药在肿瘤细胞的聚积、减少耐药[8]。

　　流式细胞仪检测可见Celecoxib处理24h后出现G0/G1期阻滞，G0/G1期细胞所占的比例明显增多，S期细胞明显减少。而且不同浓度(10、20、40μmol/L)的Celecoxib均可诱导MCF7细胞发生凋亡，凋亡细胞百分数分别为(9.44±2.56)%、(21.54±3.52)%和(35.57±4.86)%，而对照组几乎检测不到凋亡细胞(1.62±1.14)%。而且细胞凋亡率与药物浓度呈正相关，COX2 mRNA表达也随着药物浓度的增高而逐渐降低。本研究结果提示：Celecoxib对乳腺癌细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡作用可能与COX2表达下调、PGE2水平下降及G0/G1期细胞阻滞有关。其具体机制尚需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]HARRIS RE, CHLEBOWSKI RT, JACKSON RD, et al. Breast cancer and nonsteroidal antiimflammatory drugs: prodpective results from the Womens Health Initiative [J]. Cancer Res, 2003, 63(18):60966101.

　　[2]康华峰，王西京，刘小旭，等. 塞来昔布对大鼠化学性乳腺癌的抑制作用及机制 [J]. 华中科技大学学报(医学版), 2007, 36(6):736739.

　　[3]DAI ZJ, WANG XJ, LIU XX, et al. Upregulation of cyclooxygenase2 gene expression correlates with tumor angiogenesis in human breast cancer [J]. Chin J Cancer Res, 2003, 15(2):149151.

　　[4]CHANG SH, LIU CH, CONWAY R, et al. Role of prostaglandin E2 dependent angiogenic switch in cyclooxygenase2 induced breast cancer progression [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(2):591596.

　　[5]ELI Y, PRZEDECKI F, LEVIN G, et al. Comparative effects of indomethacin on cell proliferation and cell cycle progression in tumor cells grown in vitro and in vivo [J]. Biochem Pharmacol, 2001, 61(5):565571.

　　[6]SIMEONE AM, LI YJ, BROEMELING LD, et al. Cyclooxygenase2 is essential for HER2/neu to suppress retinamide apoptotic effects in breast cancer cells [J]. Cancer Res, 2004, 64 (4):12241228.

　　[7]王西京，代志军，刘小旭，等. 乳腺癌中COX2、HER2的表达及其相关性 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2004, 25(2):176179.

　　[8]SOROKIN A. Cyclooxygenase2: potential role in regulation of drug efflux and multidrug resistance phenotype [J]. Curr Pharm Des,2004,10 (6): 647657.