宫颈鳞癌放疗前后病理组织学、细胞凋亡、增殖细胞核抗原及p53的变化

　　作者：刘凌，程惠敏 作者单位：徐州市中心医院放疗科，江苏 徐州 221009

　　【摘要】 目的 探讨放疗前后宫颈鳞癌组织细胞凋亡情况以及p53蛋白的表达对宫颈鳞癌组织细胞凋亡的影响。方法 32例放疗前、后的宫颈鳞癌活检标本，分别进行凋亡细胞的原位检测(TUNEL)、增殖细胞核抗原(PCNA)、p53蛋白的免疫组化染色检查。结果 宫颈鳞癌放疗后细胞凋亡指数明显高于放疗前(26.63±0.37 vs. 11.03±0.33，P<0.01);高增殖能力组细胞凋亡指数明显高于低增殖能力组(20.00±15.56 vs. 5.21±3.79,P<0.05)。放疗后的PCNA表达指数显著低于放疗前(31.00±10.63 vs. 78.50±6.30,P<0.01)。放疗前后p53染色阳性率差异无显著性(P>0.05);p53阳性组细胞凋亡指数与p53阴性组差异无显著性(P>0.05)。结论 宫颈鳞癌组织中细胞增殖活跃则自发性凋亡相应增多;放疗后PCNA指数显著降低，而凋亡指数显著增高。

　　【关键词】 宫颈鳞癌;细胞凋亡;增殖细胞核抗原;p53蛋白;放射治疗

　　Observation on the alterations of cervical squamous-cell carcinoma in pathology,

　　apoptosis, PCNA, and p53 before and after radiotherapy

　　LIU Ling1, CHENG Huimin2

　　(1.Department of Radiotherapy, Central Hospital of Xuzhou, Xuzhou, Jiangsu 221009, China;

　　(2.Department of Pathology, the Third Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221003)

　　Abstract: Objective To investigate the apoptosis of cervical squamous-cell carcinoma cells before and after radiotherapy as well as the impact of p53 expression to the cells. Methods Biopsy cervical samples taken before and after radiotherapy in 32 patients with cervical squamous-cell carcinoma underwent apoptosis examination by in-situ TUNEL, PCNA and p53 staining by immunohistochemistry, respectively. Results The apoptotic index in cervical samples taken after radiotherapy was significantly higher than those taken before radiotherapy (26.63±0.37 vs. 11.03±0.33，P<0.01). Apoptotic index of cell with high proliferative activity was significantly higher than that of cells with low proliferative activity (20.00±15.56 vs. 5.21±3.79, P<0.05). PCNA index after radiotherapy was significantly lower than before radiotherapy (31.00±10.63 vs. 78.50±6.30, P<0.01). There were no significant differences in the p53 expression rate between cervical samples taken before and after radiotherapy (P>0.05). No significant differences were observed in apoptotic index between p53 positive group and p53 negative group (P>0.05). Conclusion Of the tissues in cervical squamous-cell carcinoma, cells with high proliferative activity are apt to undergo spontaneous apoptosis; PCNA index was significantly lower following radiotherapy with a remarkable increase in apoptotic index.

　　Key words: cervical squamous-cell carcinoma; apoptosis; proliferating cell nuclear antigen (PCNA); p53 protein; radiotherapy

　　宫颈癌是我国女性高发肿瘤之一，宫颈癌的主要组织学类型为鳞癌，放射性治疗是宫颈鳞癌治疗的有效手段之一。目前国内有关宫颈鳞癌组织放疗后肿瘤凋亡、增殖的研究较少，因此我们应用免疫组织化学染色及TUNEL染色，检测32例宫颈鳞癌活检标本放疗后的病理组织学变化及与肿瘤细胞增殖、凋亡有关指标增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、p53的变化，以探讨放疗对于宫颈鳞癌组织细胞增殖、凋亡的影响。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般材料 宫颈鳞癌患者32例，均为作者在徐州矿务局总医院放疗科1997年1月—2000年12月收治的病例。所有病例于放疗前和放疗后1个月在相应区域取材，经甲醛固定、石蜡包埋连续切片后，分别进行苏木精-伊红染色、TUNEL染色、PCNA和p53免疫组织化学染色。

　　1.2 方法

　　1.2.1 TUNEL染色 常规脱蜡脱水，过氧化氢封闭后，微波处理20 min。TDT酶、biod UTP 37℃孵育1 h。生物素标记-HRP 37℃孵育1 h。DAB显色、衬染、脱水、封片。用已知的阳性对照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.2 PCNA和p53免疫组化染色 PCNA采用兔抗人单克隆抗体(PC10),p53免疫组化采用抗p53蛋白鼠单克隆抗体(DO-7)。切片均用10 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH 7.2)沸腾处理20 min，用一抗处理过夜。每组切片应用各自的抗体温育，PBS液分别冲洗3次;DAB显色。用已知的PCNA、p53阳性对照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3 结果判断标准

　　1.3.1 病理组织学的评价标准 主要为核变性、核溶解、胞质角化(空泡化)、异物巨细胞反应、癌组织再生反应、间质炎性反应、纤维化、核分裂指数、间质退变等。

　　1.3.2 PCNA和p53免疫组化染色判定 PCNA和p53染色阳性为棕黄、棕褐色，定位于肿瘤细胞的细胞核，随机选取10个高倍视野， 计数阳性细胞数，计算阳性率。其中p53阳性细胞计数>10% , 判定为阳性;PCNA阳性细胞数>50%，判断为肿瘤组织增殖能力高。

　　1.3.3 凋亡指数 细胞核染成棕褐色为凋亡细胞， 随机计数10个低倍镜视野凋亡细胞数作为凋亡指数。

　　1.4 统计学处理 计量资料以±s表示，组间比较采用t检验;计数资料组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 苏木精-伊红染色结果 32例宫颈鳞癌组织苏木精-伊红染色切片按国际肿瘤组织分级标准进行分级，其中Ⅰ级8例，Ⅱ级15例，Ⅲ级9例。

　　2.2 放疗前、后病理组织学的变化 放疗前肿瘤细胞生长活跃，核分裂易见，放疗后癌细胞出现核碎裂、消失、细胞质角化改变(P<0.01);核分裂指数显著低于放疗前(P<0.01)。异物巨细胞反应、间质炎性反应、间质退变、微血管变化发生率均显著高于放疗前(P<0.05或0.01)。见表1。表1 宫颈鳞癌组织放疗前、后病理组织学的对比(略 )

　　2.3 放疗前、后细胞凋亡的改变 凋亡阳性细胞分布于癌巢各个部位，单个存在，周围无炎性细胞，胞膜、核膜完整，清晰可见，部分阳性细胞核固缩，胞质呈空泡状，可见凋亡小体被吞噬现象。32例宫颈鳞癌细胞凋亡指数放疗后显著高于放疗前(P<0.01)。见表2。

　　2.4 PCNA和p53免疫组化结果 放疗前20例增殖能力高，12例增殖能力低;放疗后13例增殖能力高，19例增殖能力低。放疗后的PCNA表达指数明显低于放疗前(P<0.01)。放疗前后p53蛋白阳性率差异无显著性(P>0.05)。见表2。

　　2.5 凋亡指数在不同组中的比较 高增殖能力组凋亡指数明显高于低增殖能力组(P<0.05);p53阳性组与p53阴性组凋亡指数差异无显著性(P>0.05)。见表3。2 放疗前后凋亡指数、PCNA和p53蛋白的变化(略 )表3 细胞凋亡指数在不同组中的比较(略 )

　　3 讨 论

　　细胞凋亡是一种具有特定形态和生化改变的细胞死亡过程。因其与生物进化、细胞增殖密切相关，且在肿瘤治疗中有重要的作用，近年来逐渐受到重视[1]。凋亡可发生于所有未经治疗的肿瘤中，考虑与肿瘤坏死因子(TNF)、细胞毒T细胞、癌基因表达及自发调节有关。当细胞凋亡发生时，可产生一系列特征性的变化，包括细胞固缩、核固缩、凋亡小体产生等细胞形态方面的变化和细胞内核酸内切酶激活而产生DNA片段化等生化方面的变化。TUNEL方法由于能够在原位显示片段化的DNA，具有可以结合细胞的镜下形态来研究凋亡的优点，从而被广泛应用。我们选择32例放疗前、后的宫颈鳞癌标本进行TUNEL研究,结果显示，93.75%的宫颈鳞癌标本可见程度不等的凋亡细胞核阳性，说明在宫颈鳞癌组织中存在着自发性凋亡的机制。放疗后凋亡指数显著增加。肿瘤细胞受照后凋亡指数的变化呈现一种时间、剂量依赖性，即达到平台的时间相对稳定[2]。这种在一定的剂量范围内，随着剂量的增加，凋亡指数也随着增加，开始较快，以后变缓，逐渐变平，进一步增大剂量反而会降低凋亡指数的机制的意义及与宫颈鳞癌的发生、发展、治疗和预后的关系，有重要的临床意义，值得进一步研究。

　　PCNA是一个判断细胞增殖活性的有效标志物[3]。王建东等[4]将PCNA与鼻咽癌放射敏感性联系起来研究，认为PCNA指数高则肿瘤对放疗敏感;相反，PCNA指数低则肿瘤对放疗不敏感。我们的研究结果显示，高增殖能力的宫颈鳞癌组织凋亡指数显著高于低增殖能力的癌组织，本结果与程继东等[5]的报道相一致。至于癌组织中细胞增殖能力增强、凋亡细胞数随之增多的原因有以下几种可能性：①营养因素。随着细胞增殖能力增强，肿瘤组织增殖过程中的营养需要也随之增多，伴随肿瘤血管的供应不足，部分细胞可因缺氧等因素产生凋亡。②增殖期细胞较静止期细胞在遗传等方面的稳定性差，易受内外因素的影响。③肿瘤是一种异常增生的组织，作为一种非常规的增生方式，常常引起细胞核分裂不完全、多倍体、异倍体等现象。

　　p53作为细胞凋亡的重要调控基因已有广泛研究。 Clarke等[6]认为，细胞凋亡和p53的关系有2种形式，一种形式为p53依赖性，另一种形式为非p53依赖性，即p53仅仅在某一些细胞凋亡中起作用。本实验中p53蛋白表达阳性组与阴性组凋亡指数差异无显著性，一种可能是由于在肿瘤组织中影响凋亡的因素较多，而本研究的病例数尚少;另一种可能性是宫颈鳞癌细胞凋亡是非p53依赖的。其相关机制尚需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Stephens LC, Schultheiss TE, Small SM, et al. Response of parotid gland organ culture to radiation [J]. Radiat Res，1989,120(1):140-153.

　　[2] 李 方,石廷章.细胞凋谢与肿瘤[J].国外医学·肿瘤学分册,1994，21(4)：193-196.

　　[3] Kawai T, Suzuki M, Kono S, et al. Proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in lung carcinoma. Correlation with DNA flow cytometric analysis [J]. Cancer,1994,74(9):2468-2475.

　　[4] 王建东，高菊珍,杨志伟.增殖细胞核抗原和毛细血管间距与宫颈癌放射敏感性的关系[J].中华放射肿瘤学杂志，2001，10(2)：122-124.

　　[5] 程继东，李 淳，沈忠英.食管癌自发细胞凋亡和核增殖抗原p53关系的研究[J].中华肿瘤杂志，1998，20(6)：415-417.

　　[6] Clarke AR, Purdie CA, Harrison DJ, et al. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways [J]. Nature,1993,362(6423):849-852.