siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长 因子基因表达的作用

　　作者：徐文华，葛银林 　(青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室，山东 青岛 266021)

　　[摘要]目的 研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。方法利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段，转录针对VEGF mRNA的siRNA，通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC-7901细胞，设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照，用MTT法检测细胞抑制率，流式细胞仪检测细胞周期的改变，RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化，ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果 所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长，并使细胞周期阻滞于G0 /G1 期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制，明显减少;同时，对应的VEGF蛋白水平也显著降低，作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论 体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。

　　[关键词] RNA干扰;胃肿瘤;血管内皮生长因子类;基因表达

　　THE EFFECT OF siRNA ON THE EXPRESSION OF HUMAN GASTRIC CANCER CELL LINE SGC-7901

　　XU WEN-HUA， GE YIN-LIN

　　(Department of Biochemistry and Molecular Biology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo evaluate the gene expression of VEGF by RNA interference in human gastric cancer. Methods siRNAs targeting VEGF mRNA was obtained by in vitro transcription， which was transfected into human gastric cancer cell lines SGC-7901 with Lipofectamine 2000. The non-transfected cells， cells treated with Lipofectimine and cells treated with SCR were taken as controls. MTT was used to detect the inhibitive rate of cell growth. Flow cytometry was used to detect the changes of cyc-ling of the cell. The inhibitive effect of siRNA on mRNA level was detected by RT-PCR， the secretion of VEGF protein in the su-pernatant by ELISA. ResultsThe small interfering RNA (siRNA) targeting human VEGF effectively inhibited the proliferation of gastric cancer SGC-7901. It affected the distribution of cell cycle， increased cell population in G0 /G1phase and decreased it in S phase. The expression of VEGF mRNA was significantly inhibited in SGC-7901;otherwise，VEGF protein notably decreased， but the effects did not appear in control scramble siRNA. ConclusionThe level of VEGF gene expression of SGC-7901 cells can be declined by transfected with siRNA.

　　[KEY WORDS]RNA interference; gastric neoplasms; vascular endothelial growth factor; gene expression

　　肿瘤血管的形成受多种因子的调节，其中血管内皮生长因子(VEGF)是作用最强、特异性最高的一种能刺激细胞运动和肿瘤血管生成的因子，与肿瘤的发生、发展关系密切。将外源性或内源性双链RNA(dsRNA)导入细胞后引起与该段RNA同源的 mRNA产生特异性降解，其相应的基因受到抑制，这种发生在转录后的基因静寂现象被称为RNA干扰(RNAi)[1～3]。体内外实验证实，21～23 bp的siRNA(small interference RNA)可特异性地发挥RNAi作用[4]。胃癌是我国最常见的消化道肿瘤， 其病死率居各种恶性肿瘤之首[5～7]。探索治疗胃腺癌的新方法具有重要临床价值。本实验以VEGF基因为靶标，设计合成siRNA，通过脂质体转染的方法将其转入胃腺癌细胞株SGC-7901，研究其静寂VEGF基因表达的效应，为临床进一步应用提供理论依据。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料及其来源 SGC-7901细胞购自中国协和基础学院细胞中心。DMEM培养基、LipofectamineTM2000、TRIzol Reagent、RPMI 1640购自Invitrogen公司。T7 Ri-boMAXTMExpress RNAi System试剂盒、Access RT-PCR Introductory System购自Promega公司。 四唑氮蓝(MTT)购自Sigma公司。人VEGF ELISA　Kit购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 siRNA的制备 从GenBank中获取已知的人VEGF mRNA序列(ACCESSION:AB021221)。依据Promega公司提供的设计软件和试剂盒设计合成siRNA序列，见表1。

　　表1 设计合成的siRNA序列(略)

　　1.3 细胞培养 SGC-7901细胞用含体积分数0.10新生牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数为0.05 CO2 条件下培养。

　　1.4 MTT法检测细胞抑制率 取对数生长期的SGC-7901细胞，配制6×107 /L浓度的细胞悬液，加到96孔板内(Corning，美国)，每孔加100 μL。设空白对照组、脂质体组、错义序列组(错义序列组SCR序列与siRNA2 序列有相同的GC组成，但是和人的 mRNA没有明显的同源性，以此作为阴性对照[8])、siRNA各剂量组，每组5孔，接种24 h后弃去上清，采用脂质体包裹的方式转染siRNA。siRNA1 和siRNA2 两组分别设立4个浓度，分别为100、200、400、1 000 nmol/L，分别定义为低、中、高、极高剂量组;siRNASCR组只设 200 nmol/L ，加含各浓度的siRNA Opti-MEM培养基 100 μL ;脂质体组只加脂质体，空白对照组只加Opti-MEM培养基100 μL，置于37 ℃、含体积分数 0.05 CO2、无血清培养基中继续培养6 h，每孔补加新生牛血清10 μL，继续培养。脂质体组Lipo-fectamineTM2000用量为每孔0.5 L，按Lipo-fectamineTM2000使用说明书操作。于24 h后分别加入MTT 10 μL，振荡15 min，酶标仪读出吸光度( A )值。计算细胞抑制率。

　　1.5 流式细胞仪观察转染siRNA后细胞的凋亡 各组细胞以1.5×105 /L密度接种于25 cm2 培养瓶，以1.4方法转染后继续培养48 h，胰酶消化离心收集并悬于PBS中，4 ℃、体积分数0.70的乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙锭(PI)的染色液染色30 min。应用流式细胞仪(EPICS-ELITE- ESP)进行细胞周期分析，每个样本约检测 11 000个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。

　　1.6 RT-PCR检测转染细胞VEGF mRNA表达水平 各组细胞以1.0×105 /L密度接种于6孔板， 24 h后 弃去上清，加入siRNA1 、siRNA2 、siRNASCR200 nmol/L，按1.4方法转染24 h后胰酶消化，离心收集。TRIzol提取各组细胞总RNA，取1 g总RNA进行RT-PCR扩增。VEGF引物:上游引物:5′-TCCGGGCCTCCGAAACC-3′，下游引物:5′-CCTGGTGAGATCTGG-3′，扩增产物为421 bp;内参照GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)引物:上游:5′-ACTGCCACCCAGAAGACT-3′，下游:5′-GCT-CAGTGTAGCCCAGGAT-3′，扩增产物为292 bp。将PCR扩增产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳观察并照相，然后应用天能分析软件对条带进行扫描，检测各组VEGF mRNA与其对应的内参 GAPDH mRNA RT-PCR产物的吸光度( A )值，计算 AVEGF/ AGAPDH的比值。

　　1.7 VEGF蛋白分泌量分析 收取转染24 h后细胞上清用于检测VEGF蛋白分泌量。严格按试剂盒说明操作，将不同浓度的VEGF标准品(7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 ng/L)以及不同组细胞上清液于Rayto 2100C酶标仪中检测450 nm吸光度( A )值。读板后仪器自动绘制标准曲线并计算出各待测样本的VEGF含量。

　　2 结果

　　2.1siRNA对SGC-7901细胞生长的抑制 siRNA1 、siRNA2 的低、中、高剂量组的吸光度值与空白对照组比较，差异均有极显著意义( F= 12.264 ，q=9.827～10.260，P <0.01);极高剂量组的吸光度值与脂质体组比较差异有显著意义( q= 7.231 ，P <0.05)。错义序列组、脂质体组与正常对照组比较差异无显著性( P >0.05)。不同剂量各组之间比较，中剂量组吸光度值最低，抑制率最高( q= 10.198～ 10.260，P <0.001)。见表2。

　　2.2 细胞转染siRNA后对细胞周期的影响与空白对照组比较，siRNA作用的细胞G0 /G1 期(细胞静止期和DNA合成前期)比例升高，S期(DNA合成期)比例降低;错义序列组、脂质体组与空白对照组比较无明显差异。见表3。

　　2.3细胞转染 siRNA 后各组 VEGF mRNA 表达水平 电泳结果显示，空白对照组、脂质体组、错义序列组421 bp处均见清晰条带，siRNA各组条带均明显减弱(见图1)，各组内参照GAPDH条带一致。空白对照组、脂质体组、siRNASCR组、siRNA1 组、siRNA2 组 AVEGF/ AGAPDH比值分别为 0.856± 0.009 、 0.834±0.020 、 0.815±0.017 、 0.456± 0.030 、 0.468± 0.019，siRNA1 、siRNA2 与空白对照组、脂质体组、错义序列组比较，差异均有极显著意义( F= 244.945 ，q=27.427～30.560，P < 0.01 )，其他各组比较差异无显著性。

　　2.4siRNA转染后24 h各组VEGF蛋白分泌量的变化 siRNA1 和siRNA2 组的VEGF蛋白分泌量明显低于其他3组，差异均有显著性( F=33.131，q= 9.036～ 12.154，P <0.01)。见表4。

　　表2 转染siRNA各组SGC-7901细胞24 h抑制率(略)

　　表3 流式细胞仪检测细胞周期变化(略)

　　图1 转染siRNA后SGC-7901细胞VEGF mRNA表达水平(略)

　　① DNA Marker;② siRNA1 ;③ siRNA2 ;④ 脂质体组

　　表4 各组SGC-7901细胞上清VEGF蛋白分泌量的比较(略)

　　3 讨论

　　胃腺癌是人类常见的癌症之一，严重威胁人类的健康和生命，发病率呈逐年上升的趋势。手术治疗可以使其中一部分病人得到治愈，但更多的病人面临错失手术时机以及术后肿瘤复发的局面。在分子生物学迅速发展的今天，寻找一条有效的胃腺癌基因水平的治疗方法具有重要的临床价值。 微血管的生成与肿瘤的生长、发展与转移密不可分，抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗研究的重要课题和热点问题。肿瘤血管的形成受多种因子调节，其中最重要的一种是VEGF，它不仅促进血管生成，还增加血管通透性，促进转移，改变宿主免疫功能。VEGF基因位于染色体的6p21.3，全长 28 kb ，编码VEGF的基因长约14 kb，由8个外显子和7个内含子交替构成。其 mRNA的不同剪接可以产生5种异构体，即VEGF121、145、165、189及206[9]。其中VEGF165是最为常见的形式，在包括胃腺癌在内的多种肿瘤中有表达[10，11]，在肿瘤微血管生成过程中扮演重要角色。通过抑制VEGF的表达抑制肿瘤微血管形成是当前抗肿瘤研究的热点之一。RNAi作为生命科学领域的新技术，其应用非常广泛，从单细胞生物一直到人，作为基因表达干预的理想方法，可应用于病毒和肿瘤的基因治疗[12，13]。本研究以人胃腺癌细胞系SGC-7901为对象，利用分子生物学技术设计、体外转录针对VEGF基因的两组siRNA，转染体外培养的SGC-7901细胞，遏制VEGF基因的表达，研究胃腺癌的防治方法。结果表明，siRNA对VEGF基因从 mRNA转录到蛋白质表达均具有明显的抑制效果，抑制了胃腺癌细胞SGC-7901的增殖，促进细胞凋亡，改变细胞周期，降低VEGF mRNA表达水平及蛋白表达水平。由此可见，在胃腺癌的抗血管生成基因治疗中，VEGF可以成为有效的靶位点。

　　本文实验所用体外转录试剂盒所转录出来的 siRNA纯度高 ，可直接应用于体外培养细胞的转染。脂质体带正电，可以靠静电作用结合RNA形成RNA-阳离子脂质体复合物，同时又吸附在带负电的细胞膜表面。因此，脂质体转染法在短期应用的基因治疗中具有明显优点。总之，本文为RNAi应用于肿瘤的基因治疗提供了一些实验基础，验证了应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤相关基因的表达，从而抑制瘤细胞的增殖、防治肿瘤的基因治疗思路，为下一步动物实验奠定了基础。当然，针对VEGF的RNAi技术临床应用于胃腺癌治疗尚需要进一步的细胞实验以及动物实验。

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